甲酰基肽受体2介导脂氧素A4减轻缺氧/复氧所致大鼠心肌细胞凋亡的作用▲

夏 剑 杨 敏 赵 剡

(1 武汉大学中南医院急救中心，2 湖北省急救与复苏临床医学研究中心，武汉市 430071，电子邮箱：jianjian_1998@sina.com)

心肌细胞缺氧/复氧在临床上非常多见，如心肺复苏术后以及感染性休克、各种原因心力衰竭导致低心排、心肌梗死等治疗后。多项研究显示，复氧后的心肌细胞出现损伤表现，导致部分细胞发生凋亡[1-2]，从而影响了心肌的协调性和顺应性，引起心肌运动功能异常，最终影响心肌的泵血功能，严重情况下可出现心力衰竭，影响患者后期生活质量。脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)作为脂氧素家族的一员，参与机体细胞的各项调节作用，包括细胞凋亡、增殖趋化、免疫调节等[3-5]。本实验旨在探讨LXA4是否可以通过结合其相关受体来调节缺氧/复氧过程中心肌细胞的凋亡，减少心肌细胞的损伤，从而起到保护心肌细胞的作用。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器 大鼠心肌细胞H9C2(美国菌种保藏中心)；杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM,Gibco Invitrogen公司,批号：11965092)；台氏液(Procell公司，批号：PH19JAN019)；LXA4(Sigma-Aldrich公司,批号：L0521)；TRIzol试剂(Aidlab公司，批号：252250AX)，反转录试剂(GeneCopoeia公司，批号：R101-01/02)；cDNA合成试剂盒(赛默飞公司，批号：K1672)。ABI7900实时荧光定量PCR仪(ABI公司)。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Abcam公司,批号：ab66110);大鼠甲酰基肽受体(formyl peptide receptor，FPR)2上游引物(5′-GCCAACTATTCCGTCCCTCT-3′)和下游引物(5′-CGGAATCCAGCTACCCAGAT-3′)、内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物(5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′)和下游引物(5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′)由擎科生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：将大鼠心肌细胞系H9C2细胞置于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL四环素的DMEM中培养2 h,每隔24 h更换培养液1次，每2～3 d传代1次。取对数生长期的细胞(2×107个/L)进行实验。

1.2.2 心肌细胞缺氧/复氧模型的建立：向瓶底覆盖有单层心肌细胞的培养瓶中加入用混合氮气(95% N2和5% CO2)饱和30 min的台氏液2 mL(PO2≤0.67 kPa)，向瓶中充入混合氮气以置换瓶中剩余的空气，封闭瓶口密闭3 h，此期为缺氧期。随后加入经混合空气(95%含量空气和5%含量CO2)饱和的含15%胎牛血清的DMEM 2 mL(PO2在17.33～20.00 kPa之间)，并持续向瓶中通入低流量(3 L/min)混合空气2 h，此期为复氧期，以此达到缺氧/复氧损伤的目的。

1.2.3 实验分组:将细胞分为3组，每组设5个复孔。(1)空白对照组，不做缺氧处理；(2)缺氧/复氧组，仅给予缺氧/复氧处理；(3)LXA4处理组，在缺氧/复氧处理后正常培养条件下培养24 h，然后给予10 nmol/L的LXA4处理12 h。

1.2.4 FPR2 mRNA表达水平的检测:运用TRIzol法(Aidlab，252250AX)提取各组每孔细胞的RNA后，将其反转录成cDNA(GeneCopoeia，R101-01/02)。取cDNA，以GAPDH为内参进行实时荧光定量PCR，反应体系包括cDNA(10×稀释)4 μL、上游引物(100 μM)0.4 μL、下游引物(100 μM)0.4 μL、SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)10 μL、H2O25.2 μL；反应条件为50℃ 2 min,95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环，采集溶解曲线。以2-ΔΔCt法计算FPR2 mRNA的相对表达量。

1.2.5 心肌细胞的凋亡检测:将无菌玻片放在细胞培养板中，24 h后光镜下观察细胞爬片状态，将爬好细胞的玻片浸入4%的多聚甲醛(pH 7.4)溶液中室温固定25 min，随后用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，5 min/次。将细胞爬片浸入用磷酸缓冲盐溶液配制的0.1%的Triton X-100溶液中2 min(冰上操作)，随后用磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，5 min/次。按照TUNEL检测试剂盒说明书操作对心肌细胞进行染色，然后在荧光显微镜(奥林巴斯BX53型生物显微镜)下观察并采集图像，绿色为凋亡细胞，在400倍视野下观察4个视野并计算凋亡指数(凋亡细胞数/总细胞数×100%)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组细胞FPR2 mRNA表达量的比较 空白对照组、缺氧/复氧组、LXA4处理组FPR2 mRNA相对表达量分别为1.15±0.14、0.52±0.10、0.81±0.09，差异有统计学意义(F=23.737，P=0.014)。缺氧/复氧组、LXA4处理组、空白对照组的mRNA相对表达量依次升高(均P<0.05)。

2.2 3组心肌细胞的凋亡情况比较 空白对照组中可见绿色荧光的少量凋亡心肌细胞，而LXA4处理组中凋亡心肌细胞较空白对照组稍有增加，但明显少于缺氧/复氧组(见图1)。空白对照组、缺氧/复氧组、LXA4处理组的凋亡指数分别为7.14±0.38、24.34±1.27、12.34±1.09，差异有统计学意义(F=237.767,P<0.001)，缺氧/复氧组、LXA4处理组、空白对照组细胞的凋亡指数依次降低(均P<0.05)。

图1 各组心肌细胞的凋亡情况(×200)

3 讨 论

心肌细胞缺血后主要导致心肌细胞的供氧缺乏，在复氧后随之出现心肌细胞代谢紊乱、细胞内离子失衡、线粒体损伤等表现，从而导致细胞内各细胞器损伤及功能障碍，诱导凋亡通路激活后将出现心肌细胞凋亡。目前，研究表明多个信号通路及凋亡因子均参与了凋亡的发生及发展过程，包括B细胞淋巴瘤-2、磷酸化B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、胞内磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3等[6-7]。

LXA4作为脂氧素家族的一员，可通过结合其受体发挥生物学效应。其主要的受体包括脂氧素受体(lipoxin A4 receptor,ALX)、芳烃受体以及半胱氨酸白三烯受体。ALX为FPR家族成员之一，FPR包括FPR1、FPR2和FPR33个成员，其中鼠科FPR2/3与人FPR2同源[8]，LXA4可通过结合FPR2来影响MAPK信号通路的亚族p38和c-Jun氨基末端激酶的磷酸化，而这两者的信号通路控制着相关细胞凋亡和细胞自噬的平衡[9-10]，因此，LXA4有可能通过结合FPR2启动MAPK信号通路，从而影响心肌细胞缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。目前，大量研究提示LXA4可通过与其特异性受体FPR2的结合影响肠黏膜细胞、肝脏细胞、肺泡细胞、各种类白细胞、牙周韧带细胞等多系统细胞的凋亡及炎症反应[11]，也有研究提表明LXA4通过影响心肌细胞钾离子通道、血红素加氧酶1、内质网应激、T-黏钙蛋白等起到调节缺氧/复氧后的心肌细胞凋亡情况[12]。但是目前LXA4是否通过结合其特异性FPR2对缺氧/复氧后的心肌细胞起到相关作用，并没有相关的系统研究报告。

本实验结果显示，给予缺氧/复氧处理后，大鼠心肌细胞系H9C2细胞FPR2 mRNA的表达降低，而应用LXA4干预缺氧/复氧的心肌细胞后，细胞中FPR2 mRNA的表达量升高，且细胞凋亡指数亦低于缺氧/复氧组，其凋亡趋势与FPR2 mRNA在心肌细胞的表达是一致的，这提示LXA4可减少由心肌细胞缺氧/复氧诱导的细胞凋亡，其可能通过结合大鼠心肌细胞系H9C2细胞上的FPR2来达到调节作用。因此，LXA4对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡而导致的心肌损伤或有一定的治疗作用。但是LXA4结合FPR2后影响的凋亡信号通路是p38和(或)c-Jun氨基末端激酶相关通路，目前还尚未完全清楚，需要进一步研究。

综上所述，LXA4的特异性受体FPR2在心肌细胞有表达，LXA4可能通过与FPR2结合调控缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡信号通路，亦抑制心肌细胞凋亡，从而起到保护心肌损伤的作用。