TRAIL与kallistatin联合表达载体的构建及抗肿瘤活性分析

王晓， 黄晓平， 刁勇

(1. 华侨大学 医学院， 福建 泉州 362021； 2. 华侨大学 生物医学学院， 福建 泉州 362021)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是一种内源性分泌肽，在外源细胞凋亡途径中与跨膜死亡配体受体DR4，DR5结合，激活DR4，DR5分子胞浆的死亡结构域，并通过激活胱天蛋白酶(caspase)级联反应，引起细胞凋亡.级联反应中的Fasl和TNF-α都有促进细胞凋亡的作用，但Fasl会导致致命的肝损伤，而TNF-α可能会导致炎症反应[1-2].TRAIL特异性地诱导肺癌、乳腺癌等多种癌细胞凋亡，且不会诱导正常细胞凋亡.临床数据显示,TRAIL产生耐药性与蛋白激酶和受体有关[3-4].联合用药既可以增强抗肿瘤活性又可以避免产生耐药性，成为TRAIL用于肿瘤治疗的研究方向.

组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗肿瘤作用[5-6].将kallistatin与TRAIL联合使用是否会增强TRAIL的抗肿瘤活性，目前还未见相关报道.因此，本文设计pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL重组载体，通过内部核糖体进入位点序列(IRES)同时表达TRAIL与kallistatin，经细胞活力和细胞凋亡实验验证TRAIL与kallistatin联合使用的抗肿瘤活性.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

菌种、细胞株和质粒E.coilDH5α，pAM-CAG，pIRES-eGFP，pCDNA3.1-Kal，pCDNA3.1-TRAIL 为本实验室保存；A549，LO-2，NCI-H446和Hela细胞株购自ATCC细胞库.

HindⅢ,EcoRⅠ,SpeⅠ,BamHⅠ等限制性内切酶、T4 连接酶、Taq DNA聚合酶(大连宝生物工程有限公司)；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒(北京天根生物科技有限公司)；兔抗kallistatin、鼠抗TRAIL单克隆抗体，羊抗兔、羊抗鼠二抗(英国Abcam公司)；kallistatin，TRAIL酶联免疫试剂盒(ELISA，美国R&D公司)；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司).

表1 扩增目的基因的PCR引物Tab.1 PCR primers for amplifying target gene

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的扩增 根据GenBank 报道的TRAIL,IRES,kallistatin基因序列设计PCR引物(表1)，分别从pIRES-eGFP，pCDNA3.1-TRAIL，pCDNA3.1-Kal质粒中扩增得到IRES，TRAIL和kallistatin目的基因.

1.2.2 重组表达载体的构建 1) pAM-CAG-TRAIL的构建.通过PCR方法从pCDNA3.1-TRAIL中扩增TRAIL目的基因，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定并对目的基因回收，回收的目的基因通过HindⅢ/EcoRⅠ双酶切回收，利用T4 DNA连接酶将目的基因TRAIL定向克隆至pAM-CAG质粒的HindⅢ/EcoRⅠ酶切位点.

2) pAM-CAG-Kal的构建.采用PCR方法从pCDNA3.1-Kal中扩增Kal目的基因，通过琼脂糖凝聚电泳鉴定并对目的基因回收，目的基因通过BamHⅠ/SpeⅠ双酶切回收，利用T4 DNA连接酶将目的基因Kal定向克隆至pAM-CAG质粒的BamHⅠ/SpeⅠ酶切位点.

3) pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的构建.采用PCR方法从pIRES-eGFP质粒中扩增IRES目的基因，将其克隆至pAM-CAG-Kal质粒的SpeⅠ/EcoRⅠ酶切位点之间，构建成pAM-CAG-Kal-IRES重组质粒，再将TRAIL目的基因克隆至pAM-CAG-Kal-IRES质粒的HindⅢ/EcoRⅠ位点之间，形成pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL重组质粒.

1.2.3 重组表达载体的表达与鉴定 构建的重组质粒pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL经过限制性内切酶鉴定，再经过DNA测序分析正确后，将提取的质粒与脂质体2000混合后转染至Hela细胞中，培养一定时间后收集培养上清及细胞，利用ELISA和western blotting方法鉴定TRAIL与kallistatin的表达情况.

1.2.4 TRAIL与kallistatin联合表达对细胞活力的影响 A549,LO-2,NCI-H446,Hela细胞分别以5 000个·孔-1的密度接种至96孔板，37 ℃,体积分数为5%的CO2培养12 h，待细胞贴壁后，分别转染pAM-CAG-eGFP,pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL质粒，转染后继续培养24,48,72 h，每孔加入10 μL 5 mg·mL-1噻唑蓝(MTT)，继续培养2 h，弃培养基，加入200 μL 二甲基亚砜(DMSO)溶解，用酶标仪检测波长为490 nm时的吸光值，根据公式计算细胞活力.

1.2.5 TRAIL与kallistatin对细胞凋亡的影响 取对数生长期的A549,LO-2,NCI-H446,Hela细胞，6孔板每孔接种50 000个细胞,培养12 h，用脂质体2000将质粒转染至细胞内继续培养36 h，胰酶消化并收集细胞，1 000 r·min-1离心5 min，磷酸盐缓冲液清洗2次；去上清并用缓冲液调整细胞浓度为1×106个·mL-1，取100 μL细胞悬液至5 mL离心管中，加入5 μL 碘化丙啶(PI)染液和5 μL Annexin-FITC染液，混匀后避光，室温染色15 min，加入400 μL 结合缓冲液混匀后,进行流式细胞分析.

2 实验结果

2.1 重组表达载体的鉴定

pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的酶切鉴定结果，如图1所示.pAM-CAG-TRAIL通过HindⅢ，EcoRⅠ单酶切未见特异性的条带，但经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后，在500 bp处出现一条特异性条带(图1(a))，与目的基因TRAIL的大小相符(516 bp)；pAM-CAG-Kal通过BamHⅠ/SpeⅠ双酶切后，在1 200 bp左右出现特异性条带，与目的基因kallistatin的大小一致(图1(b))；pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL分别经过HindⅢ/EcoRⅠ双酶切和BamHⅠ/SpeⅠ双酶切后，在500,1 200 bp处出现特异性条带(图1(c))，说明目的基因kallistatin与TRAIL已经克隆至pAM-CAG载体中.构建的3种重组质粒经DNA测序分析结果显示，插入目的基因序列完全正确.

(a) pAM-CAG-TRAIL (b) pAM-CAG-Kal (c) pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL 图1 pAM-CAG-TRAIL, pAM-CAG-Kal, pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL的酶切鉴定结果Fig.1 Identification of pAM-CAG-TRAIL, pAM-CAG-Kal, and pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL by restriction endonuclease

2.2 TRAIL与kallistatin的表达与鉴定

TRAIL诱导细胞凋亡需要与死亡受体结合才能启动凋亡信号，而可溶性的TRAIL位于胞外区，必须在细胞外才能与受体结合.采用ELISA方法检测培养基中TRAIL的质量浓度(ρ(TRAIL))，结果如图2(a)所示.由图2(a)可知：转染pAM-CAG-TRAIL质粒组的TRAIL的质量浓度为(1.85±0.18) μg·mL-1，转染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL质粒组的TRAIL的质量浓度为(1.65±0.24) μg·mL-1，两组之间的差异无统计学意义，而转染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-eGFP质粒组没有检测到TRAIL的表达.

(a) TRAIL (b) kallistatin图2 培养上清中TRAIL与kallistatin的表达量Fig.2 Expression of TRAIL and kallistatin in culture supernatant

kallistatin具有信号肽，是一种分泌性蛋白，培养基中kallistatin的质量浓度(ρ(kallistatin))，如图2(b)所示.由图2(b)可知：转染pAM-CAG-Kal质粒组kallistatin的质量浓度为(12.08±0.21) μg·mL-1，转染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL质粒组kallistatin的质量浓度为(11.73±0.37) μg·mL-1，两组之间的差异无统计学意义.

此外，利用western blotting方法检测细胞内TRAIL和kallistatin的表达，结果如图3所示.由图3可知：转染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL和pAM-CAG-TRAIL质粒组细胞内都有TRAIL的表达;转染pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL和pAM-CAG-Kal质粒组细胞内都有kallistatin的表达.

(a) TRAIL (b) kallistatin图3 Western blotting检测细胞内TRAIL与kallistatin表达Fig.3 Expression of trail and kalistatin in cells by western blotting

2.3 TRAIL与kallistatin联合表达对细胞活力的影响

TRAIL与kallistatin对细胞活力的影响,如图4所示.图4中：η为细胞存活率；*表示差异有统计学意义.由图4可知：分别转染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL质粒后，LO-2细胞存活率与对照组相比,差异无统计学意义;分别转染pAM-CAG-Kal，pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL质粒后，A549细胞存活率为78.3%±4.3%，67.4%±3.5%，53.7%±4.1%，pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-TRAIL组与pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL组相比，差异具有统计学意义，说明联合表达TRAIL和kallistatin能够显著增强细胞的抗肿瘤活性;Hela细胞的实验结果显示，pAM-CAG-Kal,pAM-CAG-TRAIL,pAM-CAG-Kal-IRES-TRAIL组的细胞存活率明显下降，分别为76.4%±5.3%，66.4%±4.3%，52.7%±3.5%，与转染pAM-CAG-eGFP组相比，差异具有统计学意义，且TRAIL，kallistatin双表达组的细胞存活率与pAM-CAG-TRAIL，pAM-CAG-Kal组相比，差异具有统计学意义，说明联合表达促进TRAIL的抗肿瘤活性;NCI-H446细胞实验结果也显示，联合表达TRAIL与kallistatin能够显著增强其抗肿瘤活性；Hela，A549和NCI-H446细胞存活率实验结果显示，TRAIL与kallistatin联合表达后肿瘤细胞活力接近半数抑制浓度IC50.

(a) LO-2细胞 (b) A549细胞

(c) Hela细胞 (d) NCI-H446细胞图4 TRAIL与kallistatin对细胞活力的影响Fig.4 Effects of TRAIL and kallistatin on cells activity

2.4 TRAIL与kallistatin联合表达对肿瘤细胞凋亡的影响

TRAIL与kallistatin对细胞凋亡的影响，如图5所示.图5中：δ为细胞凋亡率.由图5可知：TRAIL与kallistatin对LO-2细胞凋亡没有影响，与对照组相比，差异无统计学意义；而TRAIL与kallistatin能诱导A549细胞凋亡，细胞凋亡率分别为5.22%±0.34%，8.02%±0.45%，联合表达组的细胞凋亡率为10.98%±0.84%，与对照组相比，差异都具有统计学意义；Hela细胞凋亡实验显示，pAM-CAG-Kal与pAM-CAG-TRAIL组的细胞都有不同程度的凋亡，细胞凋亡率分别为5.81%±0.56%，8.62%±0.49%，与对照组相比，差异具有统计学意义，联合用药组细胞凋亡率达为12.00%±0.65%；TRAIL与kallistatin诱导NCI-H446细胞凋亡率分别为4.95%±0.43%，7.95%±0.51%，联合用药组细胞凋亡率为11.24%±0.85%.凋亡实验结果显示，TRAIL与kallistatin能够诱导A549,Hela和NCI-H446细胞凋亡，联合用药组的细胞凋亡率与TRAIL和kallistatin组相比，差异具有统计学意义，说明TRAIL与kallistatin联合使用增强了诱导细胞凋亡的功能.

(a) LO-2细胞 (b) A549细胞

(c) Hela细胞 (d) NCI-H446细胞图5 TRAIL与kallistatin对细胞凋亡的影响Fig.5 Effects of TRAIL and kallistatin on cells apoptosis

3 讨论

肿瘤形成及发展是由多基因、多因素参与的复杂过程，只进行单一的基因治疗容易忽略肿瘤变化过程中众多相对独立突变间的相互关系.自从1986年Seno等[7]成功地从大肠杆菌联合表达IFN-γ/IL-2后，越来越多基因联合治疗肿瘤的研究被报道.肿瘤的多基因联合治疗可以是同一治疗方法的两种不同目的基因的联合, 也可以是不同方案基因之间的联合，要求清楚明确各个基因的治疗作用机理，重点是两个甚至多个具有协同作用治疗基因的选择[8].对于大多数来自骨髓、前列腺、乳腺的恶性肿瘤细胞，TRAIL具有细胞毒性和抑制肿瘤细胞生长的作用，且TRAIL对正常细胞没有凋亡的诱导作用.以往研究表明，TRAIL可诱导人神经蚀质瘤细胞株(CRT2MG,U872MG)凋亡[9]，消退乳腺癌组织，并且可以剂量依赖性地抑制肿瘤的生长和肿瘤的清除[10].与TRAIL相关的Ⅰ期、Ⅱ期临床试验已经进行,如Geng等[11]将TRAIL应用于骨髓瘤的治疗.当TRAIL与受体TRAILR1和TRAILR2结合后，诱发受体在细胞膜上发生三聚化并活化caspase-8，启动两条信号通路传递凋亡信号，进而激活下游效应蛋白caspase-3，caspase-6或caspase-7，caspase-9，最终导致细胞凋亡[12].kallistatin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂.研究发现,kallistatin可以抑制NF-κB，PI3K-AKT，nucleolin等信号通路的激活[13-15]，这可能为kallistain与TRAIL联合用药增强其抗肿瘤活性提供依据.

文中构建的双表达载体pAG-CAG-Kal-IRES-TRAIL在Hela细胞中检测到TRAIL与kallistatin的表达，IRES串联的下游基因的翻译并没有受到影响，TRAIL表达量与pAG-CAG-TRAIL相比，差异无统计学意义，研究结果与Ponnazhagan等[16]一致.细胞活力和细胞凋亡实验都证实，TRAIL与kallistatin联合用药可以发挥各基因的特点，明显增强TRAIL和kallistatin的抗肿瘤活性，这预示着联合用药可能是TRAIL治疗肿瘤的一个方向.