同源盒基因MSX2在子宫内膜癌中的表达和功能研究*

万一聪，张林，姜旖，程文俊

210029 南京，南京医科大学第一附属医院 妇科

子宫内膜癌在我国女性生殖系统恶性肿瘤中发病率居第2位[1]。随着我国经济发展、饮食结构改变、人均寿命提高，子宫内膜癌发病率逐年升高，严重威胁女性健康[2-3]。近年来，同源盒基因在肿瘤发生及发展过程中的作用逐渐被发现并证实。MSX(muscle segment homebox)基因家族又称肌节同源盒基因家族，在小鼠中，MSX基因家族包含msx1，msx2，msx3三个成员[4]。而在人类，MSX家族包含MSX1和MSX2两个成员。MSX2在胚胎发育早期即有表达，与胎盘形成，器官发育调控相关。MSX2的表达能够参与细胞增殖分化的调节，并在多种成体组织中也存在表达，如乳腺组织、神经管、牙胚、眼、耳、心脏、骨骼等[5]。MSX2的突变与神经管畸形有关，可导致颅缝早期闭合[6]。近年来，越来越多的研究发现MSX基因家族在多种肿瘤中也存在异常的表达，参与肿瘤的形成[7-8]，包括乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等[9-11]。而MSX2在卵巢子宫内膜样癌中的表达与肿瘤细胞的上皮间充质转化相关[12]，但MSX2基因在子宫内膜癌中的表达却未见报道。

本研究拟通过检测MSX2基因在子宫内膜癌中的表达情况，并结合临床病理数据，分析MSX2的表达水平与肿瘤发生进展的相关性。通过体外实验，对MSX2在子宫内膜癌细胞中的功能进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 组织标本

本研究所使用的组织样本均采集自本院妇科因诊断子内膜癌而行手术治疗的患者(2008年7月至2012年12月)。其中正常增生期子宫内膜20例，子宫内膜癌96例。患者后续随访采用门诊+电话定期随访方式进行，数据资料保存完整。

1.2 材料

子宫内膜癌细胞株HEC-1-B,KLE,AN3CA细胞株购买自中国典型培养物保藏中心。Real-Time PCR试剂盒购自日本Takara公司。免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。Transwell小室购自美国Millipore公司。Matrigel购自美国BD公司。MSX2慢病毒表达载体与阴性对照载体由上海汉恒生物科技有限公司包装。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养与稳转株构建 子宫内膜癌细胞株培养:在MEM+10%FBS培养液中，将5×105细胞培养于6孔板中，按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)值，分别加入MSX2过表达慢病毒，阴性对照病毒，慢病毒感染效率超过80%。48小时后，使用5 μg/mL嘌呤霉素进行稳转株筛选3周，并通过定量PCR与western blot验证过表达效率后进行后续实验。

1.3.2 RNA提取、逆转录与Real-Time PCR实验 使用酚氯法提取细胞与组织中的总RNA，RNA经过定量后，使用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。荧光定量PCR检测样本中MSX2的表达，使用GAPDH作为内参，2-ΔΔCT分析基因的表达量。引物设计：MSX2上游引物：5′-GGAGCGGCGTGGATGCAGGAA-3′，下游引物：5′-AAGCACAGGTCTATGGAACGG-3′；GAPDH上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACTC-3′。

1.3.3 免疫组织化学实验 4 μm厚度切片经过脱蜡、水化、抗原修复、封闭后，MSX2抗体(1∶50)与切片4℃孵育过夜，二抗于37℃孵育半小时，PBS缓冲液漂洗后，加入DAB显色液显色，中性树脂封片。MSX2蛋白主要表达在细胞核中，少量表达在细胞质中。染色强度经过2位病理科医师进行独立读片。对抗体染色进行半定量打分，根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分，染色强度为0分(阴性)、1分(弱阳性)、2分(中等阳性)和3分(强阳性)。抗体表达的百分比得分为1分(0%～10%)、2分(11%～50%)、3分(51%～80%)和4分(81%～100%)。每个样本的最终分数由染色强度分数乘以染色百分比得分。得分0定义为(-)，得分1～4定义为(+)，得分5～8定义为(++)，得分9～12定义为(+++)。

1.3.4 总蛋白提取与western blot实验 使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞样本，经超声破碎后，12 500 g离心15分钟后提取总蛋白。蛋白经定量后，加入上样缓冲液，30 μg总蛋白加入SDS-PAGE凝胶进行电泳。经转膜、封闭、MSX2(1∶1 000)抗体孵育过夜、TBST缓冲液洗膜后，加入二抗，充分洗膜后，使用ECL发光液曝光。

1.3.5 CCK-8检测 按5 000个/孔种植细胞至96孔板中，细胞贴壁后。在指定时间分别加入CCK8溶液，继续培养1小时后，使用酶标仪于450 nm检测吸光值，计算细胞增殖活力。

1.3.6 细胞划痕实验 按5×105个/孔种植细胞至6孔板中，待细胞汇合度达到90%后，使用枪头进行划痕。PBS缓冲液冲洗后，细胞培养于无血清培养基中，48小时后，拍照并计算划痕距离。

1.3.7 Transwell小室实验 将基质胶按照1∶9比例稀释，并铺于小室上层，待基质胶凝固后，每孔种植104个细胞，并且在下室加入20%血清。24小时后，擦除基质胶，细胞经固定后，加入结晶紫染色细胞，显微镜拍照计数小室膜上的细胞数。

1.3.8 癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据分析 MSX2表达水平数据分析使用GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)，生存数据分析使用The human protein atlas网站(https://www.proteinatlas.org/)。

2 结 果

2.1 MSX2在子宫内膜组织中的表达水平及与患者生存的关系

MSX2mRNA在子宫内膜癌组织中的表达明显升高(图1A)。通过分析TCGA数据，MSX2基因在子宫内膜癌中表达也存在升高趋势(P<0.01)(图1B)。免疫组织化学方法检测MSX2的表达，结果显示：MSX2蛋白在正常增生期子宫内膜中表达水平较低(图1C 1)。而在子宫内膜癌组织中表达明显升高(图1C 2～5)，并且MSX2蛋白表达强度随着肿瘤分化水平降低而下降。但在子宫内膜浆液性乳头状癌(uterine papillary serous cancer,UPSC)与低分化子宫内膜癌中的表达差异无统计学意义。根据MSX2mRNA的表达水平，分为高/低表达组，Kaplan-Meier生存显示MSX2高表达的患者预后更好(P=0.036)(图1D)。使用TCGA数据集进行生存分析统计，结果与本研究结果一致，高表达MSX2的患者预后更好(P<0.001)(图1E)。

图1 MSX2基因在子宫内膜癌及正常增生期子宫内膜中的表达情况及MSX2表达水平与患者生存的关系

2.2 MSX2蛋白表达水平与子宫内膜癌的临床病理参数的关系

MSX2蛋白在子宫内膜癌组织中表达明显增高(图1C)，其表达水平在不同组织学类型、FIGO分期间的差异有统计学意义，总体而言，肿瘤分级越低，FIGO分期越早，MSX2表达越高(表1)。在不同年龄、肌层浸润深度、淋巴脉管浸润、淋巴结转移间的差异无统计学意义(表1)。

表1 MSX2表达水平与子宫内膜癌的临床病理参数的关系

2.3 MSX2在子宫内膜癌细胞中的表达及功能

使用慢病毒表达载体增强MSX2在子宫内膜癌细胞中的表达，成功构建稳定过表达MSX2的细胞株(MSX2OV)(图2A、B)，以对MSX2基因的功能进行初步研究。结果显示：过表达MSX2后，HEC-1-B和KLE细胞的增殖速度明显降低(图2C、D)。此外，过表达MSX2能够抑制细胞的迁移、侵袭能力(图3)。

图2 过表达MSX2对细胞增殖的影响

图3 细胞划痕及Transwell实验验证MSX2基因对肿瘤细胞迁移、侵袭的调控

3 讨 论

越来越多的证据表明MSX2参与了肿瘤的发展，但MSX2在不同肿瘤中的表达趋势与临床病理参数却不一致。MSX2的表达与黑色素瘤的肿瘤分期相关，生存分析显示MSX2表达阳性的患者预后更好[11]。但在前列腺癌中，骨转移性前列腺癌肿瘤中MSX2的表达上调，MSX2的表达越高，患者的无进展生存期越短。MSX2被认为是晚期前列腺癌的独立预后因素[13]。在本研究中，我们发现MSX2蛋白在子宫内膜癌中明显高表达，不同组织学类型、FIGO分期间MSX2表达差异有统计学意义。总体而言，肿瘤分级越低，FIGO分期越早，MSX2表达越高。不同年龄、肌层浸润深度、淋巴脉管浸润、淋巴结转移间MSX2表达差异无统计学意义。这提示MSX2的表达在肿瘤发生与进展中所发挥的功能可能不同。

此外，MSX2在不同类型的肿瘤细胞中可以发挥不同的生物学功能。MSX2在乳腺癌细胞中表达诱导肿瘤细胞凋亡[9]。MSX2在胰腺癌细胞中通过调控MRP2与ABCG2的表达，促进胰腺癌的耐药[14-15]。在滋养细胞中过表达MSX2，能够抑制E-cadherin的表达[16]。而在人多能干细胞中，MSX2的表达能够消除干细胞的多能性，并诱导干细胞向中胚层分化[17]。MSX2是蛋白激酶C信号调控成骨细胞分化的重要中间因子，缺乏蛋白激酶C能够抑制成骨分化[18]。在卵巢子宫内膜癌中，WNT信号维持MSX2蛋白表达，MSX2的表达能够促进细胞的侵袭[12]。但在本研究中，我们发现MSX2的表达能够抑制肿瘤细胞的增殖，降低肿瘤的侵袭和转移能力，这提示MSX2可能在子宫内膜癌中发挥抑制肿瘤进展的功能。生存分析显示MSX2高表达的患者预后更好，这也间接佐证了MSX2可能在子宫内膜癌中发挥抑癌功能的作用。

综上所述，MSX2基因在子宫内膜癌中高表达，肿瘤分级越低，FIGO分期越早，MSX2表达越高，高表达MSX2基因的患者预后更好。MSX2在体外能够抑制肿瘤细胞的增殖，侵袭和转移的能力。MSX2基因在子宫内膜癌的发生和进展过程中所发挥功能的这种不一致性，有待进一步的详细研究加以阐明。

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