血清和尿NGAL、KIM-1、CysC对晚发型败血症新生儿急性肾损伤的早期预警价值

朱道谋，钟丽花，陈彩华

(海南省妇女儿童医学中心 1.急诊科，2.新生儿科，海南 海口 570000)

新生儿败血症是新生儿期严重的感染性疾病，易导致多器官衰竭和死亡[1]。尤其是晚发型败血症(late-onset sepsis，LOS)患儿(出生72 h后发生，多见于极低体重新生儿)，病情进展迅速且肾损伤发生风险比早发型败血症更高。目前关于 LOS患儿早期急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)诊断的相关研究数据尚少，血清肌酐测定和利尿监测对于新生儿肾功能下降的评估具有一定的局限性[2]。寻找准确、可靠、敏感、特异的新生儿AKI的生物标志物具有重要的临床价值。其中血清和尿样本中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)[3]、胱抑素C(cystatin C，CysC)[4]、肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)[5]较其他指标受到更多的关注。但是尚没有研究系统比较血液样本和尿液样本NGAL、CysC、KIM-1对LOS患儿AKI的早期预警价值。在本研究中，我们将回顾性分析120例LOS患儿血清和尿NGAL、KIM-1及CysC水平与早期AKI发生的关系，并进一步比较两种样本检测对早期AKI预警的灵敏度、特异度的差异，从而为临床检验提供循证医学证据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2017年10月至2019年12月我院收治的120例LOS患儿的临床资料，所有患儿都是日龄3～14 d(中位日龄8 d)入住新生儿重症监护室，在出生≥72 h后怀疑局部感染(肺炎、泌尿道感染)或出现临床异常表现(主要是高热、呼吸窘迫、高胆红素血症和发育停滞等)，被临床诊断为败血症；其中53例患儿并发两个或两个以上器官或系统功能障碍，出现血压下降和(或)外周血灌注减少的症状，被诊断为严重败血症/败血性休克。入选标准为胎龄≥34周，出生3 d以上，具备新生儿败血症的体征和症状。所有患儿均按照医疗标准进行治疗，血液和尿液样本在-80 ℃保存用于进一步生化分析。排除尿道系统畸形、先天性疾病和确诊为严重围产期窒息的患儿以及确诊AKI之前死亡的患儿。120例LOS患儿中男76例，女44例，中位胎龄37周(34～41周)，中位出生体重2 780 g(1 320～4 790 g)，中位Apgar 1 min评分6分(3～8 分)，中位 Apgar 5 min评分8分(5～10分)。新生儿重症监护室住院原因包括高胆红素血症、发育停滞、呼吸窘迫和疑似感染。用改良AKIN分期系统进行评估，将患儿分为分为AKI组(n=23)和非AKI组(n=97)。

1.2 AKI诊断标准

使用改良AKIN分期系统进行评估：以入院当天的血肌酐(serum creatinine，SCr)水平作为基础值，入院48 h内SCr值较基础值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)；或者入院7 d内经推测或经明确后新生儿出现肾损害，SCr升高至≥1.5倍基础数值；或持续6 h的尿量<0.5 ml·kg-1·h-1。另外根据AKI分级标准，将患儿AKI程度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。Ⅰ级：48 h内SCr值较基础值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)，或SCr升高至1.5～1.9倍基础数值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持续6～12 h；Ⅱ级：SCr升高至2.0～2.9倍基础数值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持续>12 h；Ⅲ级：SCr升高至≥3.0倍基础数值，或Scr≥353.6 μmol·L-1，或无尿时间超过12 h。

1.3 检测方法

(1) 所有新生儿在入院时进行一系列实验室检查，包括全血细胞计数、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、葡萄糖、电解质和血培养，以及必要的生化评估和动脉血气分析；还进行了尿液分析和尿液培养。以上所有报告的数据均由我院检验科医师审核后出具。(2)血清和尿NAGL、CysC、KIM-1水平检测：血液和尿液样本在入院后2 d内采集4次(0、12、24、48 h)，置于冰箱中直至离心。离心后将上清液在-80 ℃下保存。采用Maglumi2000电化学发光免疫分析仪和ELISA试剂盒检测血清和尿中NGAL、CysC、KIM-1水平。NGAL试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司(板内、板间变异系数分别为3.6%和7.9%)；KIM-1试剂盒购于瑞士澳斯邦公司(板内、板间变异系数分别为4.4%和4.9%)；CysC试剂盒购于北京世纪沃德生物科技有限公司(板内、板间变异系数分别为4.2%和7.2%)；Maglumi2000电化学发光免疫分析仪购于深圳市新产业生物医学工程股份有限公司。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组患儿一般资料比较

AKI组和非AKI组患儿的性别、胎龄、日龄、出生体重、Apgar 1 min评分、Apgar 5 min评分、白细胞计数、CRP、血清肌酐(SCr)、估算肾小球滤过率(eGFR)等基础资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；AKI组患儿发生严重败血症/败血性休克的比例高于非AKI组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组LOS患儿一般资料的比较

2.2 两组患儿入院2 d内血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平变化比较

采用重复测量设计的方差分析比较两组患儿各时间点血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平:(1)不同时间点血清和尿NGAL(F时间=19.241、37.385，P<0.001)、KIM-1(F时间=8.135、11.469，P<0.05)、CysC(F时间=6.544、9.308，P<0.05)水平差异有统计学意义。(2) 两组患儿血清和尿NGAL(F组别=25.736、78.915，P<0.001)、KIM-1(F组别=14.208、29.414，P<0.001)、CysC(F组别=8.717、13.218，P<0.05)水平比较差异有统计学意义，入院后2 d内AKI组患儿血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平均高于非AKI组(P<0.05)。(3) 两组患儿血清和尿NGAL(F组别×时间=51.305、130.472，P<0.001)、KIM-1(F组别×时间=9.445、7.381，P<0.05)、CysC(F组别×时间=11.459、19.374，P<0.05)水平变化趋势有统计学意义。见表2。

表2 两组患儿入院2 d内血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平变化

2.3 多因素Logistic回归分析LOS患儿继发AKI的危险因素

以发生AKI作为因变量，将性别，胎龄，日龄，出生时体重，Apgar 1 min评分，Apgar 5 min评分，白细胞计数，CRP，SCr，eGFR，入院时尿NGAL、KIM-1、CysC水平等存在统计学差异的变量纳入回归方程，经多因素Logistic回归分析，尿NGAL、KIM-1及CysC水平升高是LOS患儿继发AKI的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 LOS患儿继发AKI的危险因素

2.4 不同AKI分级患儿入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差异

根据AKI分级标准，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别有12、7、4例患儿，Ⅲ级组患儿血清NGAL水平及尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ级组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同AKI分级患儿入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差异

2.5 入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平对AKI的预警效能

入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平对LOS患儿AKI发生的预测价值分析见表5、图1。尿NGAL的AUC大于血清NGAL，差异具有统计学意义(Z=-7.835，P<0.05)。而血清和尿KIM-1、CysC预测AKI的AUC比较，差异无统计学意义(Z=-2.315、-1.683，P>0.05)。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的AUC值均>0.7，提示血清和尿中这3个指标的预警效能良好。Spearman相关分析显示，血清和尿NGAL、KIM-1水平与实际结果的rs值均>0.4，且P值均<0.05，尤其是尿NGAL水平与实际结果的相关性最高。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC经H-L拟合优度检验，P值均>0.05，提示各指标的预测效果与实际结果拟合度良好。

图1 血清NGAL、KIM-1、CysC诊断LOS患儿早期AKI的ROC曲线

表5 入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平对AKI的预警价值

3 讨 论

3.1 LOS与患儿AKI的关系

新生儿败血症是新生儿时期一种严重的感染性疾病，因病原体侵入新生儿血液中并且生长、繁殖、产生毒素而造成的全身性炎症反应[6]。新生儿败血症往往缺乏典型的临床表现，但进展迅速，病情险恶，因此提高新生儿败血症的诊断水平具有重要的临床价值。新生儿败血症分为早发型和晚发型。早发型多在出生后72 h内起病，感染多发生于出生前或出生时，病原菌以大肠杆菌等格兰阴性杆菌为主，多系统受累、病死率高[7]。而晚发型在出生72 h后起病，感染发生在出生时或出生后，病原体以葡萄球菌、肺炎克雷伯菌为主，多出现脐炎、肺炎等局部感染病灶[8]。与成人相比，新生儿重症监护病房的新生儿患儿有着独特的AKI危险因素，这可能与不成熟的肾脏生理、母体环境、围产期事件及医源性损伤等有关。早产肾有一个出生后肾小球发生的短窗口，早产和足月肾都有一个固有的低肾小球滤过率(GFR)，易发生AKI[9]。败血症能够通过不同的病理生理途径引起AKI，在早产儿中新生儿败血症引起的AKI发病率更高，约为75.6%[10]。

3.2 AKI临床常用诊断指标的局限性

AKI是各种严重疾病中最常见的并发症之一，早期诊断对于AKI的治疗至关重要[11]。AKI以前被称为急性肾功能衰竭，其定义是肾功能突然下降，伴有SCr水平的急性和可逆性升高，并且与尿量减少有关，易导致液体平衡、电解质和废物清除率紊乱。因此目前关于AKI的诊断基本是依赖于SCr水平的升高或尿量的减少，这两者都是肾损伤的标志性指标。但是由于新生儿肾小管功能尚未发育完全，通常会出现非少尿性AKI，因此Ueno等[12]建议采用改良AKIN定义，不将尿量作为新生儿的诊断标准。AKI的早期诊断对于治疗是至关重要的，但是连续测量SCr水平对于评估肾功能的下降程度具有一定的滞后性。而且SCr是作为一种反映肾功能情况的标志分子，只是表示GFR降低后内源性标志物的积累情况，并不代表肾组织损伤程度[13]。此外，新生儿在分娩后前7 d SCr反映了母体肌酐成分的胎盘转移，因此，新生儿SCr水平的升高通常在出生后前7 d持续存在，并且会随着时间的推移而下降。目前大量的研究致力于制定一个更加标准化和准确的AKI定义，以提高新生儿AKI的早期诊断率。

3.3 NGAL、KIM-1、CysC与AKI发生的关系

本研究结果显示，早期LOS患儿入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高对于继发性AKI的发生具有一定的预警效能。AKI组患儿入院48 h内血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，并且升高趋势相较于非AKI组更明显；多因素Logistic回归分析显示，入院时血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高是LOS患儿继发性AKI发生的独立危险因素，且随着AKI严重程度增加，Ⅲ级组患儿血清NGAL水平和尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ级组。新生儿败血症被认为是通过多种不同的病理生理途径导致AKI。首先，全身炎症反应导致低血压、肾低灌注和继发性急性肾小管坏死。其次，微血管功能障碍被认为是在肾血流量正常或增加的情况下发生的，表现为GFR降低和肾小管功能不全，这在组织学上与急性肾小管坏死不同。此外，肾盂肾炎通常伴有潜在的肾道异常和先天性感染，可导致AKI。在早产儿中，由于新生儿败血症引起的AKI的发生率远远高于足月新生儿。众多研究证实，与肾损伤有关的分子如NGAL、KIM-1、CysC可用于预测新生儿败血症继发性AKI，但是其可靠性尚存有争议。El-Farghali等[14]研究发现，非败血症(n=35)和败血症(n=25)危重患儿sNGAL水平差异无统计学意义，但与无AKI组相比，AKI患儿sNGAL水平显著升高，表明NGAL是AKI的标志物，其水平升高并非败血症所致。此外，很多学者认为一些AKI的新型标志物如NGAL、KIM-1、CysC等，在直接反映肾脏损伤方面优于SCr。Shang等[15]研究表明，NGAL与肾损伤密切相关，肾损伤患者尿和血清NGAL的表达显著增加。KIM-1是一种黏附分子，也是一种跨膜蛋白，由334个氨基酸残基组成，一般由受损的近曲小管上皮细胞所表达。在正常的肾组织中，KIM-1几乎是不表达的，但是当肾脏组织缺血或肾毒性损伤后，KIM-1在损伤后的近端小管中水平明显上调。KIM-1可介导吞噬凋亡细胞并抑制免疫损伤和炎症反应等，进而作为一种保护性细胞因子参与肾损伤修复过程[16]。因此，在肾小管早期损伤的时候，KIM-1的敏感性、特异性均较高。CysC是包含120个氨基酸的小分子碱性蛋白，其氨基酸序列在体内表达相对稳定，一般情况下其在血液中的浓度变动很小。肾小管不主动分泌CysC，但CysC可自由透过肾小球滤过膜，并且在近曲小管处被分解和重吸收，因此CysC水平变化也可反映肾小球滤过功能的损害[17]。在本研究中，我们发现AKI组LOS患儿血清和尿NGAL、KIM-1及CysC的水平均显著升高，并且在入院48 h内持续升高。

3.4 血清和尿NGAL、CysC、NGAL水平对AKI的预警价值

本研究结果显示，血清和尿NGAL、CysC、NGAL对于LOS患儿继发性AKI都有一定的预警价值，且血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的H-L拟合优度检验显示，均P>0.05，提示各指标的预测效果与实际结果拟合度良好。但是尿NGAL的预警效能大于血清NGAL，而且与实际结果的相关性更高；而血清和尿KIM-1或CysC对AKI的预警效能基本一致。NGAL被称为lipocalin2，最初被描述为一种由多种人类细胞表达的癌基因，包括上皮细胞和中性粒细胞，可通过肾脏被迅速排出，半衰期为10～20 min[18]。因此相较于血清NGAL，尿NGAL水平升高更能够反映肾小管内皮细胞的损伤情况，但是并不能反映GFR的下降。此外NGAL也是中性粒细胞活化的重要标志物，血清NGAL水平升高易受到其他炎症感染因素的影响，因此若要进一步证实尿NGAL相较于血清NGAL对LOS患儿继发AKI的预警效能更高，则需要从NGAL的起源和作用机制、代谢特点等方面进行更深入的分析。

综上所述，LOS继发性AKI患儿表现为早期血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，相较于血清NGAL，检测尿NGAL水平对于AKI的预警效能更高，而对于KIM-1和CysC指标，我们并未发现血清和尿预警效能的差异性。