引起部分奶牛场呼吸道疾病的主要病毒性病原检测

毕玉彧，宋丽丽，王冬鸣，薛 原，宋晓飞，张连秀，李金波

（1.齐鲁动物保健品有限公司，山东济南 250105；2.山东省重大动物疫病新兽药创制技术重点实验室，山东济南 250105；3.天津市北辰区畜牧兽医局，天津 300400）

牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）是严重危害养牛业的一类疾病，其主要病毒性病原包括牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）以及牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）[1]。研究[2]表明，BRDC是奶牛场中最常见的一类疾病，全球约46%的犊牛患有BRDC，严重影响养牛业的健康可持续发展。其中IBRV、BVDV对牛的影响主要体现在经济效益方面，可导致感染牛生产性能下降，如增重减缓、产奶量下降、流产率升高等[3-4]，严重时，可造成感染牛死亡。IBRV、BVDV感染牛后均可导致免疫抑制与持续性感染，且易发生混合感染[5-6]，给奶牛场带来巨大经济损失与防疫压力[7-8]。BPIV3又称运输热，单独感染时症状较轻，但易与IBRV、BVDV等发生混合感染[9]。

近年来，我国东北地区以及山东、河北、天津、甘肃等省（市）奶牛场相继发生了以流黏性鼻液为主的呼吸道疾病，且排除了牛支原体、牛巴氏杆菌感染可能，由此怀疑由牛呼吸道病毒引起。本研究通过采集相关样品，对发生呼吸道症状的奶牛场进行IBRV、BVDV、BPIV3 PCR检测，并将抗原检测结果与奶牛场发病情况进行分析，以期为奶牛场呼吸道疾病防控提供依据。

1 材料

1.1 样品来源

2018—2019年，在山东、河北、甘肃和天津4省（市）的5家发生流黏性鼻液的奶牛场，采集发病牛与无症状牛鼻拭子298份，具体信息如下（表1）。

表1 奶牛场信息 单位：份

1.2 相关毒株及试剂

1.2.1毒株 IBRV、BVDV、BPIV3阳性毒株，均由齐鲁动物保健品有限公司分离、鉴定并保存。

1.2.2试剂 2×TaqPlus MasterMix（Dye），购自康为世纪生物科技有限公司；一步法RT-PCR试剂，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；核酸提取或纯化试剂，为杭州博日科技有限公司产品；DMEM细胞培养液，购自Gibco公司。

2 方法

2.1 鼻拭子采集

使用长杆无菌棉拭子深入牛鼻腔内部，贴近黏膜旋转多圈，然后将棉拭子放入DMEM细胞培养液（含10%新生牛血清以及10万IU青链霉素）中，低温运输，充分振荡后2 500g/min离心5 min，取上清液过滤备用。

2.2 引物来源与PCR检测

参照行业标准[10-11]与学位论文[12]设计PCR检测引物（表2），并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。对鼻拭子样品使用核酸自动提取仪提取DNA/RNA，然后进行IBRV/BVDV/BPIV3 PCR检测，同时设立阴、阳性对照。

表2 引物信息

3 结果

3.1 鼻拭子PCR检测

结果（表3）显示：5家奶牛场IBRV、BVDV阳性率分别为28.9%、7.1%，BPIV3未检出。其中发病牛IBRV阳性率为42.6%，无症状牛IBRV阳性率为10.9%；发病牛BVDV阳性率为11.3%，无症状牛BVDV阳性率为1.6%。

表3 鼻拭子PCR检测结果 %

3.2 IBRV、BVDV混合感染情况

结果（表4）显示，5家奶牛场IBRV、BVDV混合感染率为5.7%。其中IBRV、BVDV混合感染占IBRV总感染数的19.8%，占BVDV总感染数的81.0%。

表4 IBRV、BVDV混合感染情况 %

4 讨论

5家奶牛场出现以流黏性鼻液为主的临床症状后，进行了牛支原体与牛巴氏杆菌检测，结果均为阴性，因此怀疑与牛呼吸道相关病毒有关，故采集部分发病牛与无症状牛鼻拭子样品开展相关病毒核酸PCR检测。结果发现，发病牛部分鼻拭子样品为IBRV和/或BVDV阴性，也存在无症状牛鼻拭子样品IBRV和/或BVDV核酸阳性情况。推测其原因可能为：一是牛感染病毒后排毒期与表现临床症状期不对应[13-14]，出现“发病牛有临床症状但不排毒以及无症状牛无临床症状但排毒”情况；二是IBRV、BVDV均具有隐性感染特性，在病毒处于休眠时患畜不排毒，当动物受到应激后排毒，而此时临床症状还未表现，可导致无症状牛鼻拭子检测呈阳性；三是与牛个体情况、牛场环境因素有关[15]。

IBRV是导致奶牛流黏性鼻液的主要病原，且鼻液中含毒量高，因此本研究中IBRV检出率高于BVDV。BVDV虽然也可引起牛呼吸道症状，但不是主要病因，更多时候起辅助其他病原侵袭动物机体作用。BPIV3在奶牛发生应激时易感，如天气骤变、长途运输等，本试验中奶牛未经历明显应激活动，这也是BPIV3未检出的原因之一。研究表明，牛感染BVDV后由于免疫力下降，更易感染IBRV[16]，这与本试验中IBRV、BVDV混合感染占BVDV感染比率较高相一致。当感染BVDV牛继发感染IBRV后，可加速IBRV在牛群中传播。

此外，奶牛场疾病防控的难点之一是BVDV持续感染（persistently infected，PI）牛的存在。虽然大部分PI牛由于免疫抑制、发育迟缓等原因过早死亡或淘汰，但仍有部分PI牛存活并长期散毒，导致其成为奶牛场中BVDV的主要传染源[17]，为奶牛场混合感染其他病原提供了条件。

有文献[18]指出，我国不同地区IBRV感染率为5%～88%，平均感染率由2013年的32%提高至目前的43%，这说明IBRV在我国不同地区流行广泛且呈上升趋势，牛群感染IBRV的风险不断增大。由于IBRV引起的临床症状相对轻微，奶牛场对IBRV危害普遍认识不足，尤其是没有从继发感染、流产率升高、产奶量下降等方面考虑其危害，因此相关防控措施不到位，IBRV感染常发，再连同牛群BVDV感染等因素，加重了牛场疫病的流行与经济损失。此外，本研究中5家奶牛场临床症状相似，但不同奶牛场不同病原阳性率有差别（比如奶牛场C、E）。推断除排毒期与表现临床症状期不对应之外，也存在除IBRV、BVDV以外其他病原体的可能，如牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial virus，BRSV）以及其他病原体等，这还需进一步检测研究。因此，奶牛场在日常做好IBRV、BVDV、BPIV3抗原检测及PI牛检测与淘汰外，也必须重视BRSV等其他病原检测，避免混合感染发生，最大限度降低奶牛场呼吸道疾病造成的危害。