我国部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因序列及遗传变异分析

张思远，卢秀娴，梁昭平，林举攀，黄 芬

（1.华南农大生物药品有限公司，广东广州 510300；2.华南农业大学，广东广州 510642）

鹅星状病毒（goose astroviruses，GoAstV）是近年危害我国养鹅业的重要病毒性传染病病原之一[1]。GoAstV感染主要发生于3周龄以内的小鹅，导致其出现食欲下降、精神萎靡、脚软等临床症状，以及肾脏等内脏组织及关节腔发生白色尿酸盐沉积，死亡率较高，可达50%[2]。星状病毒（astroviruses，AstV）1975年首次被发现，是一种单股正链RNA病毒，无囊膜[3]，存在于多种动物体内，对其感染宿主既有种属特异性，也具有跨种间传播能力，对新宿主、新环境适应能力很强[4]。不同种属的AstV基因组间长度差异较大，全长6.1～7.9 kb，含有5'端未翻译区（untranslation region，UTR）、3个开放性阅读框（ORF1a、ORF1b和ORF2）、3'UTR及多聚腺苷酸（PolyA）尾[5]。不同种属AstV的3个ORFs中变异性最大的是ORF2，内部容易出现氨基酸突变[6]。

近年来，我国部分地区商品雏鹅群陆续发生高度致死性内脏痛风病，其中AstV感染是主要病因之一，给养鹅业造成了巨大经济损失。为进一步了解我国GoAstV的遗传变异方向，对2019年山东、江苏、广东、安徽等省份分离到的10株新型GoAstV进行ORF2基因序列测定及遗传进化分析，以期为该病防治提供流行病学数据，为深入研究该病致病特点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒

毒株由华南生物公司动物疫病诊断中心实验室从山东、江苏、广东、安徽等省份发病鹅病料中分离，经RT-PCR鉴定为新型GoAstV。其中：AstV/Goose/GD35/2019、AstV/Goose/GD776/2019分离自广东省，AstV/Goose/JS166/2019、AstV/Goose/JS343/2019、AstV/Goose/JS376/2019、AstV/Goose/JS944/2019分离自江苏省，AstV/Goose/SD534/2019、AstV/Goose/SD1008/2019分离在山东 省，AstV/Goose/AH605-1/2019、AstV/Goose/AH605-2/2019分离自安徽省。

1.2 主要试剂及仪器

核酸自动提取试剂盒，购自天隆公司；pMD19-T载体、DL 2 000 DNA Marker，购自TAKARA公司；2×TaqPlus Master Mix，购自Vazyme公司；Fast King RT Kit With gDNase、琼脂糖凝胶回收试剂盒以及核酸染料，购自天根公司产品。全自动样品快速研磨仪，购自QIAGEN公司；核酸自动提取仪，购自西安天隆公司；PCR仪，购自伯乐公司。

1.3 引物设计与合成

参照NCBI官网GenBank中登录的GoAstV序列，采用Primer 6.0软件设计ORF2基因全长扩增引物序列（表1）。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

表1 GoAstV ORF2基因全长引物序列

1.4 RNA提取及反转录

按照天隆公司的核酸自动提取试剂盒使用说明书提取病毒总RNA，根据天根公司的Fast King RT Kit With gDNase试剂盒说明书反转录成cDNA，然后置-70 ℃保存备用。

1.5 ORF2基因扩增及测序

以上述cDNA为模板进行GoAstV的ORF2基因扩增。RT-PCR反应体系为50 μL。反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s、53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；终延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果；切下目的片段，按切胶回收试剂盒使用说明书进行目的片段回收，然后连接到 pMD19-T载体；将目的基因转化到DH5α感受态细胞宿主菌，37 ℃培养后，挑取单个菌落于LB液体培养基（含有氨苄青霉素）中振荡培养14～16 h；经PCR鉴定阳性克隆菌液后，提取阳性质粒送至上海生工生物工程有限公司广州测序部测序，测序结果用DNAstar软件进行拼接分析。

1.6 ORF2基因序列分析

将运用DNAstar和MEGA7.0等生物软件获得的GoAstV ORF2基因序列与GenBank下载的参考序列比对，进行同源性比较和基因序列分析。

2 结果

2.1 ORF2基因扩增

经琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功扩增到ORF2基因片段，与预期扩增长度一致，约2.2 kb（图1）。

图1 10株新型GoAstV ORF2基因PCR扩增结果

2.2 ORF2基因同源性分析

本试验的10株毒株ORF2基因编码区均由2 115个核苷酸组成，编码705个氨基酸。10株GoAstV毒株间ORF2基因核苷酸同源性为96.2%～99.9%，氨基酸同源性为96.3%～99.9%；10株病毒与目前已公布的流行毒株序列同源性较高，核苷酸同源性为96.3%～99.2%，氨基酸同源性为96.3%～99.4%；与能导致雏鹅肠炎的AstV（FLX）及其他种属禽源AstV的核苷酸及氨基酸同源性相对较低，仅为26.5%～57.3%。

2.3 ORF2氨基酸变异分析

将10株GoAstV与其他AstV分离株进行比较，结果发现ORF2基因N端保守性较高，而C端存在差异性。本试验以AstV/Goose/SDPY/1116/17为参考毒株进行氨基酸位点分析，发现10株毒株之间存在部分氨基酸位点差异，分别位于第26、225、229、268、284、376、379、424、456、464，540、587、610、614、695位氨基酸（表2）。这些突变位点主要集中在衣壳蛋白的纤突结构。

表2 10株GoAstV ORF2蛋白主要氨基酸位点比较

2.4 ORF基因遗传进化分析

将分离株与GenBank上下载的序列进行ORF2基因序列遗传进化树分析，发现10株分离毒株与近年报道的引起痛风的新型病毒AstV/Goose/SDPY/1116/17等聚成1个分支，亲缘关系最近，与其他AstV遗传距离较远，形成独立的进化支（图2）。

图2 10株GoAstV与参考毒株ORF2基因序列遗传进化树

3 讨论

新型GoAstV感染作为一种新发传染病，2017年被我国研究人员首次报道[7]，随后越来越多的感染病例被发现。感染AstV的鹅主要表现为精神沉郁、行动迟缓、关节肿胀、站立不稳、单脚跛行等临床症状[8]，以及关节腔及肾脏等内脏器官的严重尿酸盐沉积等病理变化。该病发病率和死亡率均较高，给养鹅业造成了重大经济威胁。AstV具有宿主多样、跨种传播以及适应新宿主、新环境能力强等特点，能引起广泛疾病，如鸡感染AstV会导致腹泻性肠炎和肾炎[9]，雏鸭感染则引起病毒性肝炎[10]等，不同宿主感染后所出现的临床症状及病变差异性较大。AstV还可以通过胚胎垂直传播，使得AstV净化异常困难[11]。

AstV的衣壳蛋白主要由ORF2基因编码，是其主要结构蛋白，其中衣壳内侧的壳体蛋白由第73～256位氨基酸组成，而第425～665位氨基酸则构成壳体外侧的纤突蛋白[12]；纤突蛋白是AstV主要的抗原决定蛋白，病毒的主要中和抗体表位于此蛋白上，并且能介导细胞表面受体与病毒粒子的结合[13]。AstV的ORF2基因编码的衣壳蛋白也是AstV种属、基因分型的划分依据[14]。衣壳蛋白作为AstV的结构屏障，可与宿主抗体、补体发生相互作用，激发宿主免疫应答，在病毒粒子组装以及入侵宿主细胞等过程发挥极大作用[15]。AstV的ORF2基因N端保守性较高，其编码的蛋白位于病毒粒子外表面，富含碱性氨基酸，参与识别细胞表面相关受体及机体的免疫应答，并参与病毒基因组的包装与衣壳芯的形成；C端属于高变区，其编码的蛋白是病毒主要的抗原决定性蛋白，在病毒粒子表面形成纤突结构，参与病毒与宿主细胞膜融合，在病毒感染和致病过程中产生重要影响[16]。

本试验对2019年我国部分地区分离到的10株新型GoAstV进行ORF2基因序列测定及遗传进化分析，发现毒株与近年新型GoAstV流行毒株遗传关系最近，10株毒株之间的氨基酸同源性介于96.3%～99.4%。与参考毒株AstV/Goose/SDPY/1116/17相比较，10株毒株的ORF2基因编码氨基酸序列差异主要集中在衣壳蛋白的纤突结构；由于纤突蛋白在病毒致病过程中起到重要作用，相关氨基酸位点差异可能会导致病毒致病性不同，但能否对蛋白的构象、功能以及病毒毒力构成影响，仍需进一步研究。本试验中有4株出现了E456D以及L540Q突变。这两个位点氨基酸易接触抗体，以至于受到的抗体压力较强。另外有4株Q229P、1株T376A、1株A614N氨基酸发生突变。这些位点与病毒遗传进化有关，可激发易感宿主产生特异性抗体，在外界环境及抗体作用压力下加快病毒进化，从而累积更多的变异点。病毒不同传代代次全基因组序列分析[17]表明，在病毒连续传代过程中，衣壳蛋白出现了6个氨基酸位点突变，分别位于衣壳蛋白的第26、284、489、610、650和660位。本试验中只有1株E610G发生突变，有可能促使改变其编码蛋白构象，对雏鹅的致病力变弱。冯崇伦等[18]对衣壳蛋白晶体结构进行解析，发现GoAstV衣壳蛋白P2结构域内第489、610、650、660位氨基酸的变异，可能会改变其编码蛋白VP27的相关构象，对病毒粒子在雏鹅体内的增殖造成影响，从而降低病毒对雏鹅的致病力。

GoAstV感染是导致鹅痛风的主要原因之一。另外造成鹅痛风的原因还有其他内外源性因素，如长时间摄入高蛋白质饲料引发的蛋白质代谢障碍和肾脏损伤等[19]，因此需要注意与新型GoAstV引起痛风病的鉴别诊断。本试验对我国部分地区分离到的10株新型GoAstV进行ORF2基因序列分析比较，发现毒株之间存在氨基酸位点突变，这为后续深入研究新型GoAstV的分子生物学特性及其疫苗研制提供了数据参考。