广西中越边境地区蜱种类分布及其非洲猪瘟病毒携带情况调查

何成伟，万道正，钟 勇，蓝翊文，廖才伟，龙书汉，韦景耀，叶海波

（1.凭祥海关，广西凭祥 532600；2.南宁海关，广西南宁 530029；3.东兴海关，广西东兴 538100）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的猪烈性传染病。该病2018年8月首次发现于我国辽宁省，随后疫情从东北地区迅速蔓延至全国各地，对我国养猪业造成了不可估量的经济损失。2019年2月20日，越南向世界动物卫生组织（OIE）首次报告发生ASF疫情，其后疫情席卷越南全境。与越南毗邻的我国广西也于2019年2月发生了首例ASF疫情。蜱在ASFV传播过程中扮演着重要角色。ASFV可在钝缘蜱属（Ornithodoros）的软蜱体内复制，从而使蜱成为病毒的储存库，经叮咬可引起猪感染[1]。据刘建等[2]推测，软蜱最适生长温度为22～30 ℃，最适湿度为75%～95%。广西属亚热带季风气候区，全年平均气温为16.5～23.1 ℃，雨水丰沛，季节变化不明显，很适合蜱繁殖。目前关于广西蜱种类的报道始见于廖国厚等[3]的硬蜱调查，但至今未见关于软蜱的报道。鉴于ASFV可在蜱体内长期存在，而且可在野猪-蜱-家猪三者间循环传播，因而不能忽视蜱传播ASFV的潜在风险[2]，尤其是广西。为了解广西中越边境地区蜱的种类分布及其ASFV携带情况，开展了此次流行病学调查，以期为广西中越边境地区ASF防控决策提供依据。

1 材料与方法

1.1 蜱捕捉地点及时间

广西地处南疆边陲，有8个市（县）与越南毗邻，山水相连，没有天然屏障。边境线长1 026 km，有194条通道可通行机动车辆。本次蜱采集区域主要靠近中越边境线，包括东兴市马路镇、东兴镇、峒中镇，宁明县爱店镇、桐棉镇，龙州县水口镇、武德乡，凭祥市友谊镇、凭祥镇、上石镇，靖西市龙邦镇、宁安乡，那坡县平孟镇。捕捉时间为2019年6月—2020年11月。

1.2 蜱采集方法

1.2.1游离蜱 采用布旗法，用90 cm×60 cm的白布旗，在调查区域内定时拖蜱。手持旗杆伸向一侧，使旗子平铺于草丛上，等速缓步前行，每步行10 m停下观察1次，将附于旗上的蜱捡入容器内，带回实验室统计捡获蜱总数，同时进行蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。

1.2.2寄生蜱 采集鼠、狗、牛、羊、蝙蝠等动物体表寄生蜱于容器内，带回实验室统计捡获蜱总数，以及蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。

1.3 蜱分类鉴定

按《中国国境口岸病媒生物及动物虫媒病》[4]和《中国国境口岸医学媒生物鉴定图谱》[5]进行。

1.4 ASFV核酸检测

ASFV核酸检测，比如样品处理、核酸提取等，严格按照《实验室生物安全通用要求》（GB 19489—2008）执行[6]。

1.4.1仪器和试剂 全自动核酸提取仪（型号GeneRotex96），西安天隆科技有限公司提供；荧光定量PCR仪（型号Quantstudio 7 Flex），美国ABI公司提供；病毒DNA/RNA提取试剂盒（批号20082320T014、20112510T014），西安天隆科技有限公司提供；荧光PCR快速检测试剂盒（批号20191102、20200803），郑州中道生物技术有限公司提供。

1.4.2蜱处理 将整只蜱置于组织匀浆器中充分研磨，加入1 000 IU/mL的青霉素、1 000 µg/mL的链霉素[7]、0.1 mol/L的灭菌PBS（pH7.4），制备10% 组织匀浆液，2 000 r/min离心处理10 min，取上清液，标记编号，立即进行ASFV检测或冷冻储存备用。

1.4.3引物和探针 针对ASFVB646L基因保守序列[7]设计引物和探针。上游引物VP72-F1：5'-GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCT-3'；下游引物VP72-R1：5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3'：TaqMan探 针VP72-T1：FAMCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGBHQ1。

1.4.4核酸扩增 按试剂盒说明书进行。扩增条件：50 ℃孵育2 min；95 ℃预变性3 min；预扩增，95 ℃变性5 s，55 ℃退火延伸30 s，5个循环；扩增，95 ℃变性5 s，55 ℃退火延伸30 s，40个循环。荧光通道选择FAM，在扩增阶段每个循环的55 ℃时收集荧光信号。设置扩增体系为25 µL，同时选择passive reference和quencher为none模式。

1.4.5结果判定（1）基线和阈值设定。基线调整取6～15个循环的荧光信号，阈值设定以阈值线刚好过阴性对照检测荧光曲线的高点为原则。（2）质量控制。阴性对照应无特定扩增曲线，且Ct ＞38.0或无；阳性对照Ct ≤30.0，且扩增曲线明显；否则试验视为无效。（3）样品判定。待检样品荧光信号有指数型增加，且Ct ＜35.0，为阳性；未检测到Ct或Ct ＞38.0或无明显扩增曲线，则为阴性；35.0 ≤Ct ≤38.0时，复检1次，复检结果为阳性则判定为阳性，否则为阴性。

2 结果

2.1 蜱分类鉴定

共捕捉蜱222只，经分类鉴定属于2科5属8种；区域分布广泛，优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱。222只蜱中，有7种硬蜱，只有1种软蜱且只在蝙蝠身上捕捉到（表1）。部分蜱种鉴定照片见图1。

表1 蜱采样地点、数量及鉴定情况汇总

图1 部分蜱种鉴定照片

2.2 ASFV核酸检测

所有的222只蜱，经荧光PCR方法检测，均为ASFV核酸阴性（图2）。

图2 222只蜱的ASFV核酸检测结果

3 讨论

ASF是由虫媒双链DNA的ASFV引起猪高死亡率的病毒性疫病，自2018年8月传入我国以来，给我国养猪业造成了严重经济损失。我国对防控ASF十分重视，出台了多条政策，实施各种措施提高ASF防控能力，控制ASF的肆意传播，取得了阶段性效果。到2020年底，我国生猪产能已恢复到2017年底的90%以上。由于目前尚未有ASFV疫苗，因此防控ASF形势仍然严峻。

据报道[8]，ASFV可在蜱体内持续存活几个月到5年。软蜱科中的钝缘蜱属（Ornithodoros）是ASFV极为重要的自然宿主和储存宿主[9]。此类蜱叮咬了被ASFV感染的猪时便会携带此病毒，当其再次吸血时就会导致该病传播。历史上，在ASF传播中，钝缘蜱担当了重要角色[10]。比如，20世纪60年代，西班牙和葡萄牙的ASF疫情流行中，软蜱充当了重要的媒介和储存宿主作用[11-12]。软蜱寿命很长，有资料介绍可生存20年，大多数ASFV野毒株可在软蜱体内持续存活，可长达8年甚至终生[10]。一旦ASFV侵入蜱的生存循环圈，将对家猪带来长期威胁，难以根除。1957年ASF传入葡萄牙，直到1993年底才被净化，历时36年。1999年11月，葡萄牙南部Alentejo省一农场复发ASF疫情。调查发现，疫情发生是因猪舍内游走的钝缘蜱，而这距离最后一次疫情将近6年时间[13]。经对葡萄牙暴发的ASF疫情进行调查，发现扑灭疫情后2.50～5.25年仍有8.8%的猪场存在感染ASFV的蜱[13]。

广西蜱种类繁多，据报道[3]，已发现6属11种：爪哇花蜱（Am.javanense）、巴 氏盲花蜱（Ap.barbouri）、厚体盲花蜱（Ap.crassipes）、微小牛蜱（B.microplus）、缅甸血蜱（H.birmaniae）、具角血蜱（H.cornigera）、嗜鸟血蜱（H.ornithophila）、粒形硬蜱（I.granulatus）、卵形硬蜱（I.ovalus）、镰形扇头蜱（R.haemaphysaloides）、短小扇头蜱（R.pumilio）。此次调查于蝙蝠上捕捉到了蝙蝠锐缘蜱，表明广西中越边境地区有软蜱分布，但没有捕捉到传播ASFV风险较高的钝缘蜱。今后要扩大蜱的捕捉区域，争取捕到更多的属种，以确定广西蜱的种类分布。本次调查捕捉到的蝙蝠锐缘蜱的ASFV传播作用，有待今后进一步研究。

本次调查未在捕捉到的蜱中检测到ASFV，但广西和越南家猪中存在ASF疫情，且中越边境线上有一些散养的野猪与家猪杂交品种。这些杂交品种猪都是放养的，是实际意义上的丛林猪，和野猪生境差不多，因此存在病毒进入此循环圈的风险，今后需要继续加强对这些猪群及蜱的ASFV监测。

4 结论

调查发现，广西中越边境地区以硬蜱分布为主，但也存在软蜱；虽然未在捕获的蜱中检出ASFV，但鉴于该地区疫情形势、家猪养殖模式以及野猪分布，蜱在ASFV传播和储存方面的潜在风险依然存在。因此，需要进一步扩大区域，继续开展蜱的调查及其ASFV携带情况监测。