2019—2020年山东省中西部地区鸭源禽腺病毒病原学检测及遗传进化分析

宋一诺，邱 杨，刘奎昊，赵伊然，赵 君，牛玉娟，李 宁，刘思当

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.山东省泰安第二中学，山东泰安 271001；3.青岛大学生物医学研究院，山东青岛 266071）

禽腺病毒（fowl adenovirus，FAdV）是全球流行的常见禽类病原，可感染鸡、鸭等禽类，导致其出现不同的临床症状[1]。根据FAdV特异性抗原的不同，可分为I、II和III 3个群。其中，I群FAdV根据病毒基因组特征可进一步分为5个种（A、B、C、D、E），根据血清中和试验可分为12个血清型（1～7、8a、8b和9～11），各血清型之间交叉保护性较低或无交叉保护性。目前，我国流行的FAdV主要为I群，以血清4型（FAdV-4）、8a型（FAdV-8a）、8b型（FAdV-8b）和11型（FAdV-11）为主[2]。

FAdV-4引起的鸡心包积液综合征2015年在我国大规模暴发并广泛流行，感染鸡出现精神萎靡、低头呆立等症状；剖检可见心包内有大量淡黄色液体或胶冻样物质，肝脏出现明显坏死灶，伴有出血点或出血斑，肺、肾水肿，偶尔可见花斑肾[3-6]；组织学检测发现，肝细胞内形成明显的核内包涵体，具有特征性病变。临床上，FAdV-4常与鸡传染性贫血、传染性法氏囊病等免疫抑制性疾病病原发生混合感染[7]，导致其致病性增强，发病率和死亡率上升[8]。FAdV具有较强的水平传播和垂直传播能力，所以短时间内给我国养鸡业造成了重大经济损失[9-10]。

FAdV-4为双股线性DNA病毒，呈球形，无囊膜，外壳蛋白主要由六邻体（Hexon）、五邻体（Penton）和纤维蛋白（Fiber）构成，其中Hexon蛋白是FAdV-4的主要结构蛋白，含主要抗原决定簇，能诱导产生中和抗体，并且该蛋白与FAdV-4的致病性密切相关[11]。研究显示，FAdV不仅造成鸡群大规模感染发病，鸭群也同样受到严重威胁。早在2015年6月，有研究学者就在我国鸭群中发现了类似心包积液综合征的病症，感染鸭心包内有淡黄色或无色积液，肝脏变性肿胀或表面有出血点[9]，后进一步研究证实为FAdV-4感染所致[5]。近年来，鸭场FAdV感染愈加频繁，给养鸭场造成了较大经济损失，但具体发病原因尚不清楚，因此在鸭群中开展FAdV流行病学调查迫在眉睫。本研究于2019—2020年，针对山东省中西部地区鸭群进行FAdV病原学检测，并针对分离病毒的关键蛋白Hexon进行遗传进化和氨基酸位点分析，并将分离病毒进行纯化和全基因组测序，以期进一步丰富鸭群中FAdV流行病学数据，从而对该病综合防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

SimplyP总病毒核酸提取试剂盒，购自北京博迈斯科技发展有限公司；培养基DMEM，购自Gibco；胎牛血清，购自北京全式金生物技术有限公司；鸡肝癌细胞系LMH，为本实验室保存。

1.2 样品采集及处理

2019年1月—2020年12月，定期收集山东省中西部泰安、济宁、菏泽、枣庄、济南、德州、临沂、聊城等8个地市鸭场的疑似FAdV感染病例组织样品237份。剖检病死鸭，取适量肝、脾组织于洁净的1.5 mL离心管内，加适量PBS及灭菌小钢珠，充分研磨，反复冻融3次后，于4 ℃，9 000 r/min离心3 min，取上清；经0.22 μm滤器过滤后接种于LMH细胞，培养3 d后观察细胞病变（CPE）；若没有出现明显CPE，则盲传3代，继续观察；最后收取细胞及上清，-80 ℃保存备用。

1.3 引物设计及PCR检测

参照GenBank发表的FAdV、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭流感病毒（AIV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）以及I型、III型鸭肝炎病毒（DHV-I/III）设计检测引物（表1），以提取的核酸为模板进行PCR检测。DNA病毒反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。RNA病毒反应条件：50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。

1.4 分离毒株遗传进化、氨基酸位点分析及全基因组测序

扩增分离毒株的Hexon蛋白基因（引物见表1），连接到pMD-18T载体，转化、挑菌，将菌液PCR阳性产物送公司测序。从NCBI数据库下载不同类型FAdV参考病毒序列，用MEGA 7软件通过最大似然法绘制遗传进化树。以当前鸡FAdV-4流行毒株SDDM-15为参考毒株，分析本研究获得的分离毒株氨基酸位点变异情况。将分离得到的16株FAdV-4毒株与下载的8株FAdV-4参考毒株使用在线服务器Adaptive Evolution Server，采用3种方法（SLAC、FEL、MEME）分析其氨基酸位点受到的免疫选择压力。选取本研究分离的CHSD-2毒株进行蚀斑纯化，提取病毒核酸送上海生工生物工程有限公司进行全基因组测序分析。

表1 本研究中使用的检测引物

2 结果与分析

2.1 病原学检测

2019—2020年，在山东省中西部的泰安、济宁、菏泽和枣庄等地市（图1）共采集疑似腺病毒感染鸭病料237份，其中68份检出FAdV病原学阳性，阳性检出率为28.69%；鸭群全年四季均有FAdV阳性检出，其中6—8月份的炎热夏季和12月—次年2月的寒冷冬季阳性检出最多（图2），说明该病在冬季和夏季发病率较高。

图1 阳性样品地市分布

图2 FAdV不同月份阳性检出率变化

2.2 病毒分离及其遗传进化和氨基酸突变分析

将检测的阳性样品处理后接种LMH细胞，进行病毒分离。结果显示，样品接种72 h或盲传3代后，部分接毒组可观察到明显的CPE，如细胞聚集、变圆等（图3）。收集细胞及其上清，再次通过PCR检测FAdV，可见明亮的目的条带，说明成功分离到该病毒。本研究中，共分离到16株鸭源FAdV。

图3 接种腺病毒36 h后LMH细胞病变

为进一步了解目前鸭群中流行的鸭源与鸡源FAdV的差异性，将本研究获得的16株病毒Hexon蛋白基因进行克隆、测序，然后与其他22株参考毒株进行系统进化树分析，结果发现所有鸭源FAdV分离株与鸡源I群FAdV-4的亲缘关系最近，处在同一个分支，而与鸭源FAdV-1、FAdV-2型亲缘关系较远（图4）。

图4 基于Hexon蛋白基因序列的鸭源FAdV遗传进化分析结果

将所有鸭源FAdV分离株的Hexon蛋白与目前流行的鸡源FAdV-4参考毒株SDDM-15（登录号KU877426.1）进行同源性比对和氨基酸位点分析，结果发现16株分离病毒与参考毒株的氨基酸同源性极高（99.1%～99.9%），分离毒株彼此之间的氨基酸同源性也为98.6%～100%。分离毒株有1～7个数量不等的氨基酸突变位点，包括23、93、145、201、207、243等。值得注意的是，与鸡源SDDM-15相比，所有鸭源FAdV分离株第243位氨基酸均由丝氨酸突变为天冬酰胺（表2），且通过SLAC、FEL、MEME算法分析，发现243位点至少在两种方法的显著值内（表3），表明其受到了正向免疫选择压力。

表2 鸭源分离株和参考毒株SDDM-15 Hexon蛋白氨基酸突变位点分析结果

表3 FAdV-4 Hexon蛋白氨基酸受到正向免疫选择压力位点的不同算法分析结果

由于16株鸭源FAdV之间的同源性极高，因此随机选取1株，将其命名为CHSD-2，通过蚀斑纯化后，利用高通量测序获得其全基因组序列，发现该分离株全基因长43 724 bp（登录号MW349185）；进一步将其与鸡源FAdV-4代表毒株GDMZ（MG856954.1）、AH-F18（MN781665.1）和CH/AHWH/2018（MN606302.1）进行全基因组序列比对，结果发现4个毒株的同源性为100%，进一步证实本研究分离的鸭源FAdV与当前流行的鸡FAdV-4为同一种病毒。

3 讨论

I群FAdV具有广泛的自然宿主，不仅导致鸡、鸭、鹅等家禽发病，也感染鸽、稚鸡、鹦鹉等野生禽类[12]。自2015年FAdV-4在鸡群中引起的心包积液综合征暴发流行后，鸭群腺病毒的检出率越来越高。本研究对山东省中西部地区疑似腺病毒感染的237份病鸭样品进行病原学检测，发现FAdV阳性检出率为28.69%。吕恒欣等[13]对山东省部分地区的鸭胚、雏鸭等样品进行腺病毒PCR检测，发现阳性检出率从23.00%到57.40%不等，表明腺病毒在山东省部分地区鸭群中普遍存在。该病全年均可发生，但以冬、夏两季的发病率较高，分析原因可能是腺病毒对外界环境抵抗能力强，可耐高温和严寒，在冬、夏两季环境应激影响下鸭更易发病[14]。

整个试验中，共分离到16株鸭源FAdV。通过遗传进化分析发现，这16株鸭源FAdV与鸡源FAdV-4的亲缘关系最近，处于同一进化分支。基于FAdV主要毒力蛋白Hexon的氨基酸同源性分析发现：分离的鸭源FAdV与鸡源FAdV-4代表毒株SDDM-15具有极高的同源性，为99.1%～99.9%；每个毒株有1～7个数量不等的氨基酸突变位点，但仅243位点受到了正向免疫选择压。因此认为，此次分离到的16株鸭源FAdV和引起鸡心包积液综合征的FAdV-4属于同一种病毒。同时，进一步将分离的鸭源FAdV分离株CHSD-2全基因组（43 724 bp）与鸡源FAdV-4参考毒株GDMZ（MG856954.1）、AH-F18（MN781665.1）和CH/AHWH/2018（MN606302.1）进行全序列比对，结果发现CHSD-2毒株与鸡源FAdV-4参考毒株核苷酸同源性均为100%，也进一步佐证了上述论点。

据报道[13-14]，多数FAdV可以在健康禽体内存在，使感染禽不表现临床症状或仅表现轻微症状，但当与其他病原发生混合感染或机体抵抗力下降时，FAdV会引起相关疾病。关于鸭源FAdV-4对鸭的致病性报道不一，同一血清型不同分离株的致病性也存在不同[15]。粟元文等[16]使用鸭源FAdV-4 SC株感染雏鸭，发现该毒株可引起鸭群发病，且日龄越小越易感，死亡率也越高，其中对10日龄雏鸭的致死率可达到90%；而Li等[17]使用FAdV-4 SD0828分离株感染SPF雏鸭后未见任何临床症状和剖检病变，通过荧光定量方法也未检测到组织病毒载量。本研究中，16株鸭源FAdV-4分离株的Hexon蛋白氨基酸与鸡源参考毒株相比均有不同数量的突变，但这些突变的氨基酸能否影响病毒致病性，其重要的生物学意义如何，仍需要进一步试验证明。

由于我国部分商品肉鸭、蛋鸭场存在养殖条件差、管理水平落后、防范意识淡薄等问题，导致鸭病复杂化[20]，如鸭源FAdV检出率快速提升，并出现较高的混合感染率，使鸭病防控难度进一步增加。对于该病防控，首先要完善饲养管理，注重生物安全，利用有效手段切断腺病毒的水平传播及垂直传播；其次要选择高效疫苗，建立有效的免疫程序，这对鸭群腺病毒病防控十分必要。