2020年秋冬季四川省内江市无害化处理病死猪5种病毒核酸检测

雷明霞，徐 凯，彭 娟，李 梅，蒋 凛，余 姣

（内江市动物疫病预防控制中心，四川内江 641000）

当前，猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病是猪群中最常发生且危害较为严重的传染病[1]，临床上非典型和多病原混合感染现象较为普遍[2-5]，制约着猪养殖业的健康发展。本研究采用荧光PCR/RT-PCR方法，以无害化处理收集点的病死猪为检测对象，进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪圆环病毒（PCV-2和PCV-3）、猪伪狂犬病病毒（PRV）5种病原的核酸检测，旨在了解内江市秋冬季病死猪群中这5种病毒的感染情况，以期为该市猪病防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

在内江市5个辖区的无害化处理收集点，每天采集1～2个收集点，根据采样当日无害化收集量及死猪来源，每个来源点随机采集3头（不足3头全采）病死猪组织病料（腹股沟淋巴结）。其中：秋季于2020年10月21—26日，在10个无害化处理收集点，共采集58份样品，来源于22个规模场和7个散养户；冬季于2020年12月1—7日，在14个无害化处理收集点，共采集50份样品，来源于18个规模场和5个散养户。采集的108份样品信息详见表1。

表1 内江市秋冬季无害化处理病死猪样品采集信息统计

1.2 样品前处理

从每份组织病料（腹股沟淋巴结）的3个位置取样品共约1 g，用眼科剪剪碎混匀后装入2 mL无酶离心管中；在全自动组织研磨仪中，加入1 mL PBS和金属研磨珠研磨2 min；待匀浆后，置于高速冷冻离心机8 000 r/min离心2 min；取上清液600 µL于1.5 mL灭菌离心管中，-20 ℃保存备用。

1.3 试剂来源

TGuide磁珠法病毒RNA/DNA提取试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司（批号U8319）和西安天隆科技有限公司（批号20011710T913）；PRRSV和CSFV双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒（批号PRRSV&CSFV20200922P），购自哈尔滨元亨生物药业有限公司；PCV-2和PCV-3型双重荧光PCR检测试剂盒（批号040332002）、PRV-gE基因荧光PCR检测试剂盒（批 号040042006），均购自青岛立见诊断技术发展中心。

1.4 主要仪器设备

旋涡混匀器、单道微量移液器（德国Brand公司）、Ⅱ级生物安全柜（赛默飞世尔科技中国有限公司）、荧光定量PCR仪（Bio-Rad Laboratories Inc）、全自动组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）、高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）。

1.5 检测方法

1.5.1DNA/RNA抽提 参照磁珠法病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书，在第1孔加入20.0 mL蛋白酶K和200.0 mL样品，执行DP604-Virus或VIRUS RNA/DNA程序进行DNA/RNA抽提；抽提完毕后，在第5孔/第6孔取出RNA/DNA，用封板膜封好置于-20 ℃环境中备用。

1.5.2荧光PCR/RT-PCR扩增 PRRSV/CSFV反应体系：无菌无核酸酶水5.6 µL、RT-PCR反应液12.5 µL、酶混合液1.0 µL、荧光探针3.9 µL。在反应管中分别加入反应体系23.0 µL和DNA/RNA模板2.0 µL，做好标记，轻弹混匀并瞬时离心；将反应管置于荧光PCR仪中，分别选择FAM通道和HEX通道进行如下反应：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，循环40次，每次在循环第2步（60 ℃ 35 s）收集荧光信号。PCV-2/PCV-3/PRV反应体系：将引物探针和酶反应液瞬时离心后，将1 000.0 µL酶反应液全部移至引物探针管中，颠倒混匀6次，充分混匀，配制成50份PCR反应液。根据样品量，在每个反应管中各加入反应体系20.0 µL，再分别加入5.0 µL样品DNA/RNA模板和阴阳性对照模板，做好标记，轻弹混匀并瞬时离心；将反应管置于荧光PCR仪中，分别选择FAM通道和HEX通道进行如下反应：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，循环40次，每次在循环第2步（60 ℃20 s）收集荧光信号。

1.6 结果判定

根据试剂盒说明书进行结果判定。PRRSV/CSFV：阳性对照Ct ≤30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立；被检样品FAM荧光信号Ct ≤30并出现特异性扩增曲线，判为PRRSV核酸阳性；被检样品HEX荧光信号Ct ≤30并出现特异性扩增曲线，判为CSFV核酸阳性；若被检样品病毒含量较低，30 ＜Ct ＜36并出现特定扩增曲线，判为可疑，需重新提取样本后进行扩增，若仍为疑似，则判为阳性，其余为阴性。PCV-2/PRV-gE/PCV-3：阳性对照Ct ≤35并出现特异扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立；被检样品FAM荧光信号Ct ≤38并出现典型的扩增曲线，判为PCV-2/PRV-gE核酸阳性；被检样品HEX荧光信号Ct ≤38并出现典型的扩增曲线，判为PCV-3核酸阳性，其余为阴性。

1.7 数据统计分析

根据样品数及检测结果，采用Office Excel 2007软件计算阳性率。

2 结果与分析

2.1 不同病种

不同病种统计结果（表2）显示：PCV-2和PRRSV阳性检出率较高，样品阳性检出率分别为44.4%和33.3%，场户阳性检出率分别为46.2%和34.6%；其次是PCV-3和CSFV，样品阳性检出率分别为12.9%和7.4%，场户阳性检出率分别为11.5%和7.7%；未检出PRV。

表2 秋冬季5种病毒核酸阳性检出率统计结果 %

2.2 不同来源场点

不同来源场点统计结果（表3）显示：规模场的PRRSV、CSFV、PCV-3场户阳性检出率高于散养户，其中PRRSV和CSFV未在散养户中检出；散养户的PCV-2场户阳性检出略高于散养户。

表3 秋冬季不同来源场点的场户病原阳性统计结果

2.3 混合感染情况

混合感染统计结果（表4）显示，检测样品的混合感染率为20.4%，其中二重感染率为18.5%，主要是“PCV-2+PRRSV”“PCV-2+PCV-3”；三重感染率为1.9%，为“PCV-2+PRRSV+PCV-3”。

表4 检测样品多病原混合感染阳性率统计结果 %

2.4 不同生长阶段

不同生长阶段统计结果（表5）显示，CSFV阳性主要在保育阶段被检出，PRRSV、PCV-2、PCV-3阳性主要在育肥阶段被检出。

表5 猪只不同生长阶段病原阳性样品占比分布 %

3 讨论

3.1 CSFV

本次检测从4个不同规模养殖场检出CSFV，样品阳性检出率为7.4%，与四川省南充市（临床病料，9.21%）[6]、四川省绵阳市（病死猪组织，5.71%）[7]的检测结果类似，表明四川省实施的猪瘟过渡期政策取得较好的防控效果，尤其是散养户中未检出阳性。本次检出的CSFV阳性病料主要来源于保育仔猪。这可能同母源抗体衰减、免疫失败或注射疫苗后抗体未及时起效有关。因此，应加强母源抗体监测，及时注射猪瘟疫苗，加强疫苗运输、贮存管理，强化疫苗免疫技术培训。

3.2 PRRSV

本次检测从18个不同规模养殖场中检出PRRSV，样品阳性检出率为33.3%，高于南充市（临床病料，17.11%）[6]、遂宁市（病死猪组织，22.22%）[7]等四川省内其他地区，表明四川省部分地区PRRSV感染现象较为普遍。PRRSV在哺乳、育肥两个年龄段均有检出，其中在育肥阶段检出最多。经进一步调查发现，75%（12/16）的养猪场未免疫PRRSV疫苗，故应重视疫苗免疫，加强病原和抗体检测，推进PRRSV净化。散养户中未检出PRRSV，这可能跟饲养方式及饲养环境和密度有关。

3.3 PCV-2

PCV-2主要侵害猪免疫系统造成免疫抑制，对猪危害极大，已被证实能引起包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、皮炎肾病综合征（PDNS）、呼吸道综合征、仔猪先天性震颤、母猪繁殖障碍等一系列病症[8-9]。现临床上多采用全病毒灭活苗或亚单位疫苗在仔猪断奶后免疫[10]，起到一定的防控效果[11]。本次检测发现，PCV-2样品阳性检出率为44.4%，与四川省巴中市和乐山市（病死猪组织，40%）的检测结果类似[7]，表明猪群中PCV-2感染极为普遍。内江市散养户PCV-2检出率略高于规模场，且在猪只保育和育肥阶段均有检出，其中育肥阶段尤其严重，占比91.3%，多呈混合感染状态。这可能是因为部分规模场和散养户防疫意识不到位，基本没有进行PCV-2免疫；PCV-2阳性检出多在猪只育肥后期，说明仅在断奶后免疫1次PCV-2疫苗，不足以保护育肥阶段猪只免受PCV-2侵袭。由此建议，可根据抗体水平衰减情况，在育肥阶段加强免疫1次。此外，PCV-2存活力极强，在75 ℃加热15 min后仍具有传染性[12]，因此应注意合理采取消毒灭源措施。

3.4 PCV-3

PCV-3是2016年在美国首次报道被检出的新型圆环病毒[13]，随后在国内也检测到[14-15]。PCV-3感染可引起心脏、呼吸系统、生殖系统等多系统炎症[16-17]。此次检测的阳性检出率为12.9%，与南充市（病死猪组织，10.53%）[6]、资阳市（病死猪组织，15%）和乐山市（病死猪组织，10%）[7]的检测结果类似，说明PCV-3零星存在。内江市规模场PCV-3阳性率略高于散养，主要在育肥阶段检出，这可能跟地域分布、饲养环境和密度以及猪只对疫病的抵抗力有关。此外，该病毒在环境中广泛存在，且具备跨种传播能力[18]，需引起重视。

3.5 PRV

PRV是猪伪狂犬病病原，为自然疫源性病原[19]，主要引起神经和呼吸系统方面的疾病[20]。此次在内江市猪群中未检测到PRV野毒感染，与四川省13个地区病死猪组织检出率为0[7]的结果一致，说明PRV-gE基因缺失苗免疫取得了较好的防控效果，为后续猪伪狂犬病净化起到积极的推动作用。此外，动物疫病发生是一个动态的发展过程，因此内江市仍需要持续加强PRV检测，实时掌握其感染情况。

3.6 混合感染

本次检测结果表明，内江市存在PRRSV、PCV-2、PCV-3和CSFV这4种病原的混合感染，混合感染率为20.4%，其中双重和三重感染率分别为18.5%和1.9%，同四川泸州、遂宁、资阳、广安等13个市（28.67%）[7]、南充市（13.82%）[6]检测结果类似，表明双重感染现象普遍存在。其中双重混合感染以“PRRSV+PCV-2”“PCV-2+PCV-3”为主。PCV-2、PRRSV可引起机体免疫抑制[21]，导致对原发性和继发性病原体感染的易感性增加[22]，进而增加发病率和死亡率。所以单靠疫苗免疫来实现疫病防控是不够的，应从猪场生物安全管理角度出发进行疫病综合防控，进而实现疫病净化。

4 结论

检测发现，四川省内江市病死猪群中PRRSV、PCV-2感染较为严重，PCV-3零星分布，且呈现一定的混合感染状态，而CSFV和PRV感染得到有效控制。因此，应加强PRRSV、PCV-2、PCV-3感染的监测与控制。