高效液相色谱-串联质谱法测定莱芜香肠中3种β-受体激动剂残留

王燕红

（济南市食品药品检验检测中心，山东济南 250000）

莱芜香肠旧称“南肠”，是饮誉山东省内外的传统名吃，在莱芜有“肴上肴”美称。莱芜香肠以“莱芜黑”猪肉或精选猪肉为主要原料，制作精良，并耐储存。

克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇都属于苯乙醇胺类，其中克伦特罗属于苯胺型，莱克多巴胺、沙丁胺醇属于苯酚型[1-3]。它们都属于β-受体激动剂，俗称“瘦肉精”。将“瘦肉精”添加于饲料中，可促进蛋白质合成，加速脂肪转化和分解，从而明显提高脂肪型动物瘦肉率。“瘦肉精”在动物体内残留时间较长，短期内残留量较大，可通过食物链进入人体，给消费者身体健康带来危害[1，4-5]。我国明确禁止使用β-受体激动剂，然而受经济利益驱使，其滥用仍然禁而不止[6-7]。动物源性食品中违禁药物残留已成为世界范围内的食品卫生难题，因此研究快速测定克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇残留量检测方法具有十分重要的意义。

目前，β-受体激动剂检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）[8-10]、气质联用（GC-MS）[11-14]、液质联用（LC-MS）[15-17]、放射免疫（RIA）[18]和酶联免疫吸附测定（ELISA）[19]。其中GC-MS和HPLC法样品前处理过程较为繁琐、检测灵度低，且GC-MS法需要衍生化；ELISA法假阳性率较高；而LC-MS法能实现多种β-受体激动剂同时检测，具有高通量、高效等优点。以往药物残留研究对象主要集中于猪、牛、羊的鲜肉、肝脏及尿液等，对于肉制品则未见报道。本研究针对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等3种β-受体激动剂，首次以莱芜香肠为对象，建立快速简便、专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1标准品与试剂 盐酸克伦特罗标准物质（纯度98.5%）、莱克多巴胺标准物质（纯度95.5%）、沙丁胺醇标准物质（纯度99.0%），购自农业农村部环境保护监测所；HLB固相萃取柱（6 mL/50 0 mg）、MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg），为美国Waters公司产品；β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶，为美国Sigma公司产品；甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯），为德国Merck公司产品；氨水（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、高氯酸（分析纯），购自国药集团化学试剂有限公司；Thermo scientific 25002-052130色谱柱（50 mm×2.1 mm），购自上海精瑞科学仪器有限公司；水，来自实验室超纯水机，电导率大于18 MΩ。

1.1.2主要仪器 M3000-TSQ Endura液相色谱串联质谱联用仪，购自Thermo公司；恒温水浴振荡器，购自上海精密仪器仪表公司；漩涡混合器，购自上海苑胜仪器设备有限公司；低温高速离心机，购自美国贝克曼公司。

1.2 标准溶液配制

准确量取适量上述标准品，用甲醇溶解并定容，配置成1 μg/mL的单标储备液，置于4 ℃冰箱保存。各吸取一定量上述浓度的单标储备液，用95%甲醇水溶液配置成0.5、1.0、5.0、12.5、25.0、50.0 ng/mL的混合标准工作液。

1.3 仪器条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Thermo scientific 25002-052130（50 mm×2.1 mm）；柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量5 μL，流动相甲醇-0.1%甲酸水。梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.3.2质谱条件 串联四极杆电喷雾ESI离子源，选择正离子电离模式；喷雾电压3 500 V，雾化室温度350 ℃，鞘气流量35 mL/min，辅助气流量5 mL/min，毛细管温度350 ℃。检测条件如表2。

1.4 样品处理

1.4.1提取 准确称取研磨均匀样品2.0 g置于50 mL离心管中，加入8 mL pH5.2的0.2 mol/L乙酸铵缓冲液，再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液40 μL，涡旋混匀，于37 ℃电热恒温振荡水槽中水解过夜；取出冷却后，用高氯酸调节pH至1.0，超声振荡20 min，取出置于80 ℃水浴30 min；10 000 r/min 10 ℃冷冻离心10 min，收集上清液；残渣用0.1 mol/L高氯酸重复提取1次，10 000 r/min离心10 min，合并上清液；用1 mol/L NaOH溶液调节pH至4.0，准备过小柱净化。

1.4.2净化 HLB小柱依次用6 mL甲醇、水活化，将提取液以2 mL/min速度过柱，弃去滤液，用2 mL 5%甲醇淋洗；待小柱抽干后，再用6 mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹至近干；用3 mL 0.1 mmol/L高氯酸溶液溶解残渣，供MCX小柱净化用；MCX小柱依次用3 mL 5%甲醇氨、水、0.1 mmol/L高氯酸（pH4.0）溶液活化，将上述净化液过柱；弃去滤液，再依次用1 mL甲醇、2%甲醇水溶液淋洗，抽干后用7 mL 5%甲醇氨洗脱；洗脱液用氮气吹至近干后，用1 mL甲醇-0.1%甲酸水（V:V=1:9）复溶，旋涡混合1 min，过0.2 μm滤膜后上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱、质谱条件优化

为使组分获得更好分离效果，本试验对流动相进行了优化选择。依据文献[5]研究结果，本试验通过比较不同流动相组成对信号强度的影响，最终选择以0.1%甲酸水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，分离效果好，灵敏度高、重现性好，分离时间短。在正离子模式下，进行母离子全扫描，确定分子离子，并对仪器电离电压、锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化。经过优化得到3种β-受体激动剂的全扫描总离子流（TIC）质谱色谱图及MRM色谱图、二级质谱图（图1～2）。

表2 β-受体激动剂检测条件

图1 TIC质谱色谱图

图2 β-受体激动剂MRM色谱图及二级质谱图

2.2 标准曲线绘制

按选定的仪器条件对已配置好的系列标准溶液进行测量，以组分的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线回归方程及相关系数如表3所示，标准曲线见图3。结果显示，在此浓度范围内浓度和峰面积之间呈良好的线性关系，相关系数R2均大于0.999 6。

表3 线性回归方程与相关系数

图3 沙丁胺醇、莱克多巴胺、盐酸克伦特罗标准曲线

2.3 加标回收率及精密度测定

检出限以3倍噪声水平计算，使仪器处于走基线状态；将衰减调为最小，使其变为剧齿波动状。将3种β-受体激动剂标准溶液稀释后进样，计算可得出克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检出限均为0.25 μg/kg。采用对阴性样品进行加标回收试验来考察方法的准确度和精密度。

对本底不含3种β-受体激动剂的莱芜香肠样品，分别加入不同体积的1 μg/mL的β-受体激动剂标准混合溶液，按1.4步骤进行处理。处理成分别添加相当于5、25、45 ng/mL的3种β-受体激动剂标准溶液，计算样品加标回收率。每个质量浓度水平设6个平行样品，计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。结果如表4所示。

由表4可知，方法加标平均回收率盐酸克伦特罗为97.89%～100.21%，RSD为0.14%～1.64%；莱克多巴胺为99.53%～104.07%，RSD为0.13%～1.34%；沙丁胺醇为99.53%～101.27%，RSD为0.10%～1.67%。

表4 3种β-受体激动剂平均回收率和RSD（n=6）

2.4 样品测定

利用本方法对40份莱芜香肠制品进行检测，均未检出β-受体激动剂残留，添加回收率均为90.0%～110.0%，相对标准偏差为0.1%～2.0%，表明该方法适用性良好。

3 讨论

β-受体激动剂通常以游离和结合两种形式存在，为将其提取完全，本研究用β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液酶解，使结合型的β-受体激动剂游离出来。同时，本研究通过固相萃取法对样品进行净化，降低了脂肪等杂质干扰，起到了良好净化效果。固相萃取法不仅操作方便，也大大降低了试验成本。

本试验研究了高效液相色谱-串联质谱法检测莱芜香肠中克仑特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇3种β-受体激动剂的方法，通过对色谱、质谱条件优化，建立了可靠且可同时测定莱芜香肠中3种β-受体激动剂的HPLC-MS/MS分析方法。经样品测定，该方法精密度和准确度高，可用于莱芜香肠中β-受体激动剂的快速检测。