五虎汤抑制STAT3通路并调节哮喘小鼠Th2/Th17免疫平衡*

丁 伊，王孟清，罗银河△，胡 燕，江智豪，张 鑫，李 英，罗 菁，丁 焕，邓羿駃

（1湖南中医药大学，湖南长沙410208；2湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；3深圳市南山区蛇口人民医院，广东深圳154100；4长沙医学院，湖南长沙410219）

支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道异质性疾病，其特征在于气道炎症和支气管高反应性，导致可逆性气流受限［1］。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是婴幼儿呼吸道感染最常见的病原体［2］。哮喘的发病机制复杂多样，涉及各种免疫细胞和促炎细胞因子［3］。Th17细胞是近年来发现的不同于Th1和Th2的T淋巴细胞亚群，参与了哮喘的发生与发展［4］。越来越多研究认为Th2/Th17免疫失衡在RSV诱发哮喘的发病机理和炎症中起关键作用［5］。信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路的激活参与Th2和Th17细胞因子的产生，与哮喘的发生关系密切［6］。相关研究已证实采用小分子C188-9可以通过拮抗小鼠STAT3信号通路抑制Th2/Th17细胞因子比例水平改善哮喘小鼠炎症反应［7］。

目前临床通常认为吸入皮质类固醇可以很好地控制哮喘，但长期使用会引起各种副作用，中药已被证明对哮喘有治疗作用［8-10］。传统古方五虎汤（Wuhu decoction）具有清泻肺热、止咳平喘之功效。前期临床研究表明，五虎汤能明显减少RSV毛细支气管炎发展为典型哮喘［11］；动物实验表明，五虎汤抑制RSV复制，降低哮喘气道高反应性，改善气道炎症及气道重塑［12-13］。但关于五虎汤对RSV诱发的哮喘小鼠Th2/Th17免疫平衡机制的研究鲜见报道。因此，本研究构建RSV复合卵清蛋白（ovalbumin，OVA）哮喘小鼠模型，观察STAT3信号通路对RSV诱发的哮喘小鼠Th2/Th17的免疫调节作用及五虎汤在其中的干预作用，为阐明五虎汤缓解RSV诱发的哮喘气道免疫炎症提供新的理论依据。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物SPF级雌性BALB/c小鼠60只，4～6周龄，15～18 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物资格证书编号为SCXK（湘）2019-0004。实验方案经湖南中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准，伦理审批号为ZYFY20200712。

1.2 药物与试剂五虎汤由麻黄（不去节）2.4 g、杏仁（去尖皮）6.0 g、生石膏9.0 g、生甘草2.4 g和细茶叶4.8 g组成，每瓶100 mL，含生药24.6 g，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科制备。RSV Long株及人喉癌上皮Hep-2细胞（武汉大学医学部病毒学研究所）；鸡OVA（Solarbio，批号9006-59-1）；STAT3抑制剂Stattic（MCE，批号HY-13818）；氯化乙酰胆碱（Selleck，批号2260-50-6）；白细胞介素4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-17A和IL-23 ELISA试剂盒（上海晶天生物科技有限公司）；抗STAT3抗体（批号ab119352）和抗p-STAT3抗体（批号ab76315）均购自Abcam。

1.3 主要仪器超声雾化器（南京道芬电子有限公司，型号S888E）；DHX-50小动物呼吸机及气道阻力和肺顺应性分析软件（BUXCO）；透射电子显微镜（日立高新技术公司，型号HT7700）；台式离心机（金坛市大地自动化仪器厂，型号12008007）。

2 实验方法

2.1 动物造模及分组SPF级雌性BALB/c小鼠60只，随机分20只为正常组，其余40只为模型组。参照前期文献建立哮喘小鼠模型［12］，实验前2 d模型组每只小鼠鼻腔滴入RSV（0.05 mL）并腹腔注射0.25 mL 1%鸡OVA，正常组予以等体积Hep-2细胞滴鼻，同时皮下注射等体积生理盐水。从第9天起模型组小鼠予以1%鸡OVA隔天雾化1次，每次30 min，正常组予同样体积生理盐水雾化吸入，持续2周。雾化结束后从正常组和模型组小鼠中分别随机抽取10只进行气道反应性测定，观察到造模后小鼠气道反应性显著高于正常组并出现气短、喘息等行为学表现提示造模成功。将正常组及造模成功后的小鼠随机分成4组，每组10只，即正常（normal）组、模型（model）组、五虎汤（Wuhu decoction）组和STAT3抑制剂（Stattic）组。

2.2 给药按临床量效关系观察结果，拟定五虎汤组灌胃剂量为3.2 g/kg，同时腹腔注射0.9%生理盐水（10 mL/kg）；Stattic组腹腔注射Stattic（3.75 mg/kg），并灌胃等容积生理盐水；正常组及模型组均灌胃并腹腔注射相同体积生理盐水，每日1次，连续2周。

2.3 气道反应性的测定小鼠末次给药后24 h，麻醉、行气管插管后，把小鼠放入体描箱中，连接呼吸机，调整呼吸机参数，频率为75 min-1，潮气量为8 mL/kg时记录初始的气道压力、流速及潮气量变化，待小鼠气道压力平稳后，雾化吸入0.1 mL不同剂量（0、6.25、12.5、25和50μg/kg）的乙酰胆碱，每次吸入乙酰胆碱后，收集吸入后5 s～1 min的数据，并计算最大肺阻力（lung resistance，RL）。

2.4 组织学检查肺组织由多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，进行HE染色，梯度脱水，透明切片滴上树胶，盖上盖玻片并进行镜检。

2.5 血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23含量的测定根据ELISA试剂盒说明书的步骤，依次检测血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量，通过标准曲线计算其浓度。

2.6 肺组织中STAT3和p-STAT3蛋白水平的测定

2.6.1 Western blot法在肺组织中提取总蛋白，BAC法进行蛋白定量，每组取50μg的总蛋白，按1∶4加入SDS上样缓冲液，加热5 min后加入样品，进行电泳、转膜，封闭1 h，分别加入兔抗STAT3和抗p-STAT3多克隆抗体及内参照抗β-actin抗体孵育过夜，TBST洗涤10 min×3次，加入Ⅱ抗，孵育1 h，再用TBST洗涤10 min×3次。扫描后用Quantity One灰度分析软件，相应目的蛋白表达量为目的蛋白与β-actin条带灰度的比值。

2.6.2 免疫组化法石蜡切片脱蜡后水化，热修复抗原，加入1%高碘酸，室温10 min以灭活内源性酶，PBS冲洗3 min×3次，滴加非免疫正常山羊血清100μL，室温孵育60 min后移液枪吸去封闭液，分别滴加抗STAT3及抗p-STAT3的Ⅰ抗，4℃孵育过夜，使用PBST充分浸洗5 min×5次，辣根过氧化物酶标记聚合物，室温孵育30 min，PBST充分浸洗5 min×5次，3，3′-二甲基联苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）显色30 s，蒸馏水洗涤终止显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜下观察阳性细胞并采用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析进行阳性细胞计数。

3 统计学处理

应用SPSS 25.0进行数据统计分析。计量资料采用均数±标准差（mean±SD）表示。组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用Boferroni校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 五虎汤对哮喘模型小鼠气道反应性的影响

乙酰胆碱浓度在6.25、12.5、25和50μg/kg时，与正常组比较，模型组小鼠RL显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，五虎汤组及Stattic组的RL则显著下降（P＜0.01），见表1。

表1 各组小鼠在不同剂量乙酰胆碱激发下的气道反应性Table 1.Effects of different concentrations of acetylcholine on airway responsiveness（lung resistance，R L）in mice（cmH2O·s/mL.Mean±SD.n=10）

2 五虎汤对哮喘模型小鼠肺组织病理学的影响

HE染色结果显示，正常组小鼠肺组织周围无明显炎症细胞浸润，支气管管腔规则，气道黏膜上皮细胞完整；模型组小鼠支气管管腔狭窄，毛细血管水肿，周围可见大量炎症细胞浸润；五虎汤组和Stattic组上述肺组织损伤情况均明显减轻，见图1。

3 五虎汤对哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23含量的影响

ELISA结果显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量显著上升（P＜0.01）；与模型组相比，五虎汤和Stattic灌胃处理后小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量显著降低（P＜0.01），见图2。

Figure 2.The serum levels of inflammatory factors in mice of different groups.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs Wuhu decoction group.图2 各组小鼠血清中炎症因子含量的比较

4 五虎汤对哮喘模型小鼠肺组织中STAT3和p-STAT3蛋白水平的影响

Western blot结果显示，与正常组比较，模型组小鼠肺组织中p-STAT3/STAT3比值显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，五虎汤组和Stattic组小鼠STAT3和p-STAT3蛋白水平均显著下降（P＜0.01），见图3。

免疫组化法结果显示，正常组小鼠几乎无STAT3及p-STAT3表达；模型组小鼠中STAT3表达呈棕黄色颗粒着色，表达较正常组增加（P＜0.01），p-STAT3的变化特点与STAT3一致（P＜0.01）；与模型组比较，五虎汤组和Stattic组STAT3及p-STAT3蛋白水平均显著降低（P＜0.01），见图4。

Figure 3.The protein levels of p-STAT3/STAT3 in mouse lung tissues from different groups were determined by Western blot.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group.图3 Western blot检测各组小鼠肺组织p-STAT3/STAT3蛋白水平

Figure 4.The results of immunohistochemistry for STAT3 and p-STAT3 in mouse lung tissues fromeach group（×200），and the quantitative analysis（C）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal group；##P＜0.01 vs model group.图4 免疫组化检测各组小鼠肺组织中STAT3和p-STAT3蛋白水平

讨 论

哮喘是复杂的宿主与环境相互作用的结果，涉及免疫反应的多种表型特征。但研究表明，大多数哮喘表型与致病性Th2和Th17细胞有关［14］，Th17可以增强Th2介导的嗜酸性粒细胞哮喘的炎症反应［15］，Th2/Th17可能共同参与哮喘的发病机制。STAT3信号通路是炎症细胞因子重要信号转导通路之一，可经细胞因子和氧化刺激等激活后参与调控细胞增殖、分化及免疫调节等病理生理过程［16-17］。因此，各种细胞因子可以通过STAT3信号通路传递信息，促进炎症反应，参与哮喘发生［18］。

RSV诱导气道慢性炎症发生时，Th2细胞的主要细胞因子IL-4和IL-5大量分泌，刺激B淋巴细胞，促进炎症趋化因子的形成，从而加剧变态反应过程［19］。Th17细胞特异性产生的IL-17A可致肺组织病理学改变，出现支气管管腔狭窄及气道上皮细胞损伤等炎症反应［20］。IL-23是Th17细胞的重要存活因子，可诱导初始CD4+T细胞分化为Th17细胞［21］。STAT3是STAT3信号通路的关键因子，参与细胞内炎症反应的发生［22］。本研究结果显示，RSV诱发的哮喘模型小鼠出现肺组织损伤，血清中IL-4、IL-5、IL-17A和IL-23的含量显著上升，引起Th2/Th17免疫失衡，加重哮喘症状，同时肺组织中STAT3及p-STAT3的蛋白水平显著升高，提示哮喘小鼠中STAT3蛋白的过度表达和持续激活。本研究以治哮名方五虎汤和STAT3抑制剂Stattic进行灌胃干预处理，观察其对Th2/Th17免疫平衡和STAT3通路的影响，结果发现五虎汤和Stattic均可减轻RSV诱发的哮喘小鼠肺组织病理学改变，显著减少炎症因子的释放，降低肺组织中STAT3及p-STAT3的蛋白水平，进而纠正Th2/Th17失衡，减轻免疫炎症。

综上所述，本研究成功建立了RSV诱导的哮喘小鼠模型；五虎汤可能通过抑制STAT3通路，调节Th2/Th17免疫平衡，减少炎症因子的分泌，进而抑制免疫炎症。