延髓头端腹内侧部NADPH氧化酶2激活导致活性氧簇释放在皮肤/肌肉切开和牵拉引起的慢性术后疼痛中的作用*

代娟丽，杨 涛，魏绪红

（1华中科技大学协和深圳医院神经内科，广东深圳518052；2中山大学生理教研室，疼痛研究中心，广东广州510080；3中山大学附属第二医院麻醉科，广东广州510120）

慢性术后疼痛（chronic postoperative pain，CPSP）是在临床中长期面临但一直没有引起人们重视和解决的问题之一。据报道，普通手术如甲状腺手术或开胸手术后，约10%～50%的患者会产生CPSP，即在手术过后2个月，在排除了慢性感染、慢性肿瘤复发等情况下，手术切口部位的持续性疼痛。CPSP持续时间可达数年，对身体健康及日常活动等具有显著有害的影响［1-2］，因此预防或治疗CPSP非常有必要。虽然经过了广泛的研究，但CPSP的机制仍不清楚。据报道，由隐神经支配的大腿皮肤/肌肉切开和牵拉（skin/muscle incision and retraction，SMIR）在远离手术部位的后爪上产生了异常机械性疼痛［3］；更重要的是，相应部位的隐神经并没有发生脱髓鞘，也没有神经纤维数目的减少［3-4］，提示CPSP的发展涉及到更多相关原因。延髓头端腹内侧部（rostral ventromedial medulla，RVM）由中缝大核（nucleus raphe magnus，NRM）、网状巨细胞核（nucleus reticularis gigantocellularis，NGC）和网状巨细胞核α部（nucleus reticularis gigantocellularis pars alpha）组成，接受来自中脑导水管的信息输入，并下行传递至脊髓背角的痛觉传递神经元［5］。RVM是下行易化系统的一个重要核团。研究表明，在病理性疼痛状态下，RVM中的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）神经元可被激活，然后释放5-HT到脊髓，从而参与中枢敏化的发展和维持［6-7］。阻断RVM的下行易化作用减轻了病理性疼痛。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），如O2-和H2O2，可以与一氧化氮等形成过氧化亚硝酸盐，因而对蛋白和DNA具有过氧化作用。研究表明，ROS在神经病理性疼痛的产生中起着关键作用［8-9］。ROS水平在神经病理性疼痛时升高［10］；系统给予ROS清除剂可以减轻脊神经结扎引起的痛过敏［11］并抑制NMDA受体亚基NR1的磷酸化［12］。NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NOX）的催化亚基gp91phox（NOX2）和调节亚基p22phox在细胞膜上形成异二聚体，同时受到一些胞浆分子（p47phox、p67phox、p40phox及Rac蛋白）的调节。NOX是体内ROS的主要来源，也是体内唯一直接产生ROS的酶［13］。研究表明，在外周神经损伤或强直刺激后，脊髓背角NOX2在慢性疼痛的产生中起着关键作用［14-15］，但RVM内NOX2-ROS在CPSP中的作用尚不清楚。因此，本研究拟观察SMIR导致的病理性疼痛大鼠RVM内NOX2及ROS生成的情况，并进一步观察抑制NOX2激活或清除ROS对SMIR诱导的痛觉过敏及对RVM和脊髓背角5-HT含量的影响，以此明确RVM内NOX2来源的ROS是否通过促进5-HT向脊髓的释放来参与CPSP的发生发展。

材料和方法

1 实验动物

成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量220～250 g，由中山大学北校区实验动物中心（国家级动物实验中心）提供。于室温（22.0±0.5）℃、湿度55%±10%、12 h光照-黑暗循环、安静环境下单笼饲养，自由饮水摄食。随机进行如下分组：（1）假手术组及SMIR（1 d和7 d）组，进行行为学机械痛敏检测及NOX2和8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxyguanine，8-OHdG）免疫荧光染色半定量分析；假手术组、SMIR组、SMIR+术前RVM内注射NOX2阻断肽（gp91dstat）组、SMIR+术前RVM内注射无序肽（scrambled dstat）组、SMIR+术后RVM内注射gp91ds-tat组、SMIR+术后RVM内注射scrambled ds-tat组、SMIR+RVM注射ROS清除剂N-叔丁基-α-苯基硝酮（N-tert-butyl-αphenylnitrone，PBN）组和SMIR+RVM内注射生理盐水组，进行行为学测试及5-HT测定。每组各5只。

2 方法

2.1 SMIR模型手术根据以前的研究进行SMIR手 术［3-4］。简单地说，将动物用异氟烷（1.5%～2.5%）、30%N2O和70%O2的混合物麻醉后，在左侧后大腿内侧靠近隐静脉大约4mm处的皮肤表面做一个1.5～2.0 cm的切口，暴露出大腿肌肉。然后在大腿肌肉浅层做一个7～10 mm切口，插入微型解剖牵开器（Biomedical Research Instruments）。将大腿的皮肤和浅表肌肉牵拉2 cm并持续1 h。假手术组只进行皮肤切开但不牵拉。

2.2 50%机械刺激撤足阈值的测定按照魏绪红等［16］和汪小芳等［17］的方法进行手术同侧后肢（左侧）50%机械刺激撤足阈值的测定。实验前1周将动物放入若干有机玻璃箱内以熟悉测试环境，每天1次，每次20 min。该有机玻璃箱下方有一金属网，网格大小为0.8 cm×0.8 cm，用以将von Frey hair伸入其内测定动物撤足阈值。正式实验前先将动物放入玻璃箱内等待安静，待动物充分安静（洗脸、搔抓、直立、行走等活动完全停止）又不处于睡眠状态时，开始进行测定。实验采用Up-Down［4］的方法，选用8根强度呈对数递增的von Frey hair（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14 g）垂直向上施加于动物后肢足心部进行机械性刺激，待纤毛弯曲，停留6～8 s，若动物出现撤足，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激，若动物未撤足，则选择相邻递增的刺激强度给予刺激。每次刺激之间至少间隔5 min。按照所述方法依次使用不同强度的纤毛进行测试，待动物出现撤足反应后再连续进行5次刺激（一开始的撤足反应也算为1次）便终止测试。以第1个转折点的前一点为起始点，连续6次的刺激结果为最终的撤足反应模式，被认为是该动物的撤足反应模式。根据测试结果，通过计算公式可求出50%机械刺激撤足阈值。50%机械刺激撤足阈值（g）=10Xf+kδ/10 000。公式中Xf为最末次测试von Frey hair的对数值；K值可根据撤足反应模式查表得出［5］；δ值为8根von Frey hair间对数差值的均值。

2.3 立体定位注射药物为了将药物显微注射入RVM，我们使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并将其置于大鼠脑立体定位仪上。在头皮正中沿矢状缝做一个2 cm的切口，用30%双氧水将下面的结缔组织腐蚀溶解，清晰暴露颅骨。再次确保颅骨表面水平。接下来，用定位仪在目标核团的颅骨表面投影处进行标记，再任选该点周围任意3点处进行标记，用钻孔仪对这标记的4点分别进行开钻，将骨质钻开，目的核团投影点的钻孔深度以露出颅骨下方的硬脑膜为准，而其余3点不宜钻穿，用螺丝刀将3个螺丝钉固定于该3点内防止后续风干的牙托水与颅骨表面分离，只留下目的核团投影点用于导管的插入。此时，用定位仪小心将导管垂直插入颅骨下方目标核团内，注意应提前确保坐标无误（RVM坐标为：前囟向后-10.5 mm，中线旁开0 mm，脑表面腹侧-8.5 mm）。插入后维持导管不动，将牙托水和牙托粉以适当比例混合后均匀浇入导管和螺丝四周，待其风干后缓慢旋开导管帽以确保导管帽未与导管粘连，便于后续旋开给药。术后3 d内每天1次为大鼠肌注青霉素以防颅内感染。手术后允许动物恢复7 d。用连接至30号规格注射器的汉密尔顿注射器进行药物注射操作。在2 min内将1μL药物注入RVM。将注射针（比导管突出1 mm）保持在位60 s以使药物从尖端完全扩散。行为学实验结束后，行冰冻切片（50μm）在显微镜下进行注射位点的观察。

2.4 动物灌注及标本处理使用乌拉坦（1.5 g/kg，ip）麻醉大鼠后固定于水槽上方的板上，剪开胸腔，经主动脉快速灌注常温（25℃）的肝素化生理盐水300 mL，随后灌注4%的4℃多聚甲醛300 mL，前5 min快速灌注，后30 min慢速滴注。灌注完毕后解剖动物，取出整个大脑组织（包括大脑、小脑和脑干）后，放入4%的多聚甲醛中后固定3 h，随后转入30%蔗糖中脱水3 d。经蔗糖脱水后的标本取出进行冰冻横向切片（LEICA CM1900），厚度为40μm，收集于装有0.01 mol/L PBS的24孔板内，4℃短暂保存。

2.5 免疫荧光组织化学染色收集脑冰冻切片，6孔板装0.01 mol/L PBS洗片5 min×3次，室温（25℃）下封闭液封闭1 h。封闭后弃去封闭液，加入含有待检测蛋白抗体的Ⅰ抗稀释液（NOX2，1∶100，Affinity Biosciences；8-OHdG，1∶200，Abcam），置于4℃摇床过夜（＞12 h）。吸去Ⅰ抗，使用0.01 mol/L PBS洗片10 min×3次，随后加入针对Ⅰ抗来源的荧光Ⅱ抗，室温（25℃）下避光摇床上慢摇1 h。弃去Ⅱ抗，0.01 mol/L PBS洗片10 min×3次。使用的Ⅰ抗为抗神经元特异性核蛋白（neuron-specific nuclear protein，NeuN；神经元标志物）抗体（1∶300；Chemicon，MAB377）、抗胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；星型胶质细胞标志物）抗体（1∶500；Chemicon，MAB360）、抗离子钙结合衔接分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1；小胶质细胞标志物）抗体（1∶500；Abcam，aa221790）和抗OX-42（小胶质细胞标志物）抗体（1∶200；Chemicon，CBL1512）。随机挑选处理好的切片贴于载玻片上，使用抗荧光淬灭剂封片后立即于荧光显微镜（LEICA DFC350 FX Camera）下观察并拍照保存。采用ImageJ计算荧光光密度。

2.6 ELISA迅速提取脊髓背角L3处和脑组织RVM部分，在1 mL 1×PBS中均匀化并在-20℃下储存过夜。在进行2次冻融循环以破坏细胞膜后，将匀浆物在5 000×g，4℃离心5 min。首先用BCA法检测样品上清液蛋白浓度。再使用竞争性抑制ELISA方案，用购买的5-HTELISA试剂盒进行样品中5-HT浓度测定（Cat#CSB-E08364r，CUSABIO）。具体为将酶标板设1个空白对照孔、不加任何液体；每个标准点依次各设2孔，每孔加入相应标准品50μL；其余每个检测孔直接加待测标本50μL。检测操作严格按照试剂盒使用说明书进行。用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（A值），使用Curve Expert软件制作标准曲线以确定样品中5-HT的浓度，用测得上述5-HT浓度除以样品的蛋白浓度进行归一化处理。

3 统计学处理

使用SPSS 16.0软件进行统计分析。实验结果以均数±标准误（mean±SEM）表示。所有行为学测试结果均采用非参数检验进行分析。同一组大鼠不同测试时间点的数据先用Friedman方差分析（Friedman ANOVA）检验差异，然后再用配对的秩和检验（Wilcoxon matched pairs test）进行分析。两个不同实验组某个时间点的数据比较采用Mann-WhitneyU检验。免疫荧光光密度和ELISA测得的5-HT浓度先用单因素方差分析（one-way ANOVA）处理数据，然后用Tukey法进行多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SMIR引起长时间的机械痛敏

行为学测试发现，分别与手术前基础值或假手术组比较，SMIR后大鼠同侧后肢50%机械刺激撤足阈值于手术后1 d显著下降（P＜0.01），7 d降至最低点（P＜0.01），显著性差异一直保持至术后3周左右，术后32 d已恢复至基础水平，见图1。

Figure 1.The effect of skin/muscle incision and retraction（SMIR）on the 50%paw withdrawal threshold［von Frey（VF）hair test］.Compared with-1 d（1 d before surgery），the 50%paw withdrawal threshold was significantly decreased for 22 d in SMIR rats but not in sham rats.Mean±SEM.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs-1 d.图1 皮肤/肌肉切开和牵拉1 h对大鼠50%机械刺激撤足阈值的影响

2 SMIR引起RVM内NOX2表达上调

免疫组化染色结果显示，SMIR可引起RVM内NOX2的表达上调。如图2所示，与假手术组相比，SMIR术后1 d时NOX2的表达已显著上调，7 d时进一步上调。免疫荧光双染结果显示，上调的NOX2（7 d时）主要位于NeuN标记的神经元（图3A～C），但也部分存在于Iba1标记的小胶质细胞（图3D～F）及GFAP标记的星形胶质细胞（图3G～I）内。

3 预先RVM内给予NOX2阻断肽可防止SMIR引起机械痛敏，术后给药则无效

为了研究NOX2表达上调与疼痛的产生及维持之间的关系，我们在RVM内微量注射（注射位点见图4C）NOX2阻断肽gp91ds-tat（50μmol/L，共1μL，SMIR术前30 min开始，每天1次，共3次），结果发现gp91ds-tat可阻断SMIR引起的机械痛敏，而给予相同剂量的scrambled ds-tat则无作用（图4A）。在另外5只大鼠，SMIR后7 d开始于RVM内微量注射gp91ds-tat（每天1次，共3次），但对已经降低的机械痛阈无显著影响（图4B）。ELISA实验进一步发现，SMIR后7 d RVM和脊髓背角内5-HT的含量显著增加，术前给予gp91ds-tat显著降低了RVM和脊髓背角内5-HT的含量，而术后给予gp91ds-tat对RVM和脊髓背角内5-HT的释放均无显著影响，见图5。无论是术前还是术后给予scrambled ds-tat对SMIR引起的5-HT释放增加均无显著影响，见图5。这些结果提示SMIR后RVM内NOX2的激活可能通过引起脊髓内5-HT释放增多进而引起慢性疼痛。

4 RVM内给予gp91ds-tat可抑制SMIR引起RVM内8-OHd G生成增多

图2 皮肤/肌肉切开牵拉对RVM内NOX2表达的影响

8-OHdG是ROS攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性加合物。我们进一步观察了SMIR后不同时点8-OHdG的水平以反映RVM内ROS的生成情况。结果显示，与sham组（图6A）相比，8-OHdG在SMIR术后1 d即显著增加（图6B、D），7 d时进一步增加（图6C、D）。免疫荧光双染实验发现，SMIR 7 d时，8-OHdG在神经元和星形胶质细胞上大量存在（图6E、F），但小胶质细胞与8-OHdG共染的比例较少（图6G）。与scrambled ds-tat组相比，RVM内预先给予gp91ds-tat（SMIR术前30 min开始，每天1次，共3次）可显著降低SMIR后7 d时RVM内8-OHdG的水平（图6I～K）。

5 SMIR术后RVM内注射ROS清除剂可短暂抑制机械痛敏

SMIR术后7 d RVM内注射一次ROS清除剂PBN可以短暂翻转已经产生的机械痛敏。如图7所示，与术前相比，SMIR大鼠的50%机械刺激撤足阈值在术后7 d时已显著下降，提示产生了机械痛敏；此时给予PBN（100 mmol/L，1μL）可使大鼠的50%机械刺激撤足阈值在给药后8 h及12 h显著升高，提示RVM内ROS的持续产生是维持SMIR后慢性疼痛的关键因素。

讨 论

有研究显示CPSP主要由手术期间外周神经的损伤产生［2］。然而，近期研究表明，SMIR模型在没有神经损伤的情况产生了CPSP［3］。我们之前的研究也表明，SMIR模型并没有导致隐神经的退行性变，也没有引起L3背根神经节神经元的损伤，相反的，SMIR引起的脊髓背角小胶质细胞及星型胶质细胞的激活，并参与CPSP的产生［4］，提示中枢神经系统的改变也参与CPSP的产生。本研究发现SMIR可引起RVM内神经元及小胶质细胞内NOX2表达上调，阻断NOX2的表达可防止SMIR引起的机械痛敏并可减少RVM及脊髓背角内下行性易化递质5-HT的含量，SMIR后已经引起机械痛敏的情况下再阻断NOX2的作用则无效。其次，该研究进一步证实SMIR可导致RVM内ROS释放增多，术后7 d于RVM内注射ROS清除剂PBN可减轻已经产生的机械痛敏。

RVM的下行易化已被认为在维持神经病理性疼痛［18-19］中起重要作用。研究显示，RVM的5-HT能神经元特异性地投射到脊髓背角的浅层［20］。众所周知，脊髓背角浅层神经元接受外周伤害性刺激信息，并将信号整合后进一步上传给丘脑，因此RVM内5-HT具有下行性调制痛觉信号上传的作用是有解剖学基础的。5-HT最初被认为具有抑制疼痛的作用，是痛觉下行抑制系统释放的重要递质之一［21］，然而后来逐渐发现在外周神经损伤后其具有易化疼痛的作用［22］。相同部位释放的同一递质为何能产生不同的作用呢？这可能是因为病理性疼痛状态时脊髓背角痛觉传递神经元5-HT受体亚型的表达发生了变化，从而导致神经元的高兴奋性。在正常情况下，5-HT1A受体在中缝核和脊髓等区域高表达，RVM释放的5-HT主要发挥了突触前抑制的作用，即通过与脊髓背角内痛觉初级传入纤维末梢上的5-HT1A受体结合，抑制了初级传入纤维末梢向脊髓释放谷氨酸，从而抑制了痛觉信号从脊髓向丘脑的传递。而在病理性情况下，由于脊髓非选择性配体门控通道5-HT3受体表达上调［23］，5-HT与5-HT3受体结合，对钠、钾和钙离子通透性增加，并最终导致神经元的高兴奋性并诱导痛觉过敏［23-24］。本研究进一步发现SMIR导致脊髓背角5-HT含量增多。本实验采用细胞裂解后测定细胞匀浆中的5-HT，测定的5-HT既包含了细胞内合成的，也包含了释放到细胞外的。研究发现，脊髓所有的5-HT能传入都来自于脊髓以上结构。虽然中缝核的一小部分5-HT能神经元（其主要支配丘脑、背侧海马、纹状体和皮层）会发出侧枝到脊髓。但脊髓主要的5-HT传入来源于RVM［25］。因此我们认为脊髓的5-HT主要是RVM内5-HT能神经元的轴突末梢所释放。由此推测由RVM起源的5-HT介导的下行性易化作用在SMIR后可能增强了，并进一步作用于5-HT3受体参与了异常性机械疼痛的发生发展。

Figure 3.The cell types expressing NOX2 at 7 d after SMIR.Mean±SEM.n=3.图3 SMIR后RVM内表达NOX2的细胞类型

研究表明RVM内给予Tph-2-shRNA以特异性地耗竭内源性5-HT可以防止动物在神经损伤后出现慢性疼痛［6］，而鞘内注射选择性5-HT3受体激动剂SR57227可以诱导痛超敏反应［26］，这些结果与我们的结果相互印证。也有研究表明，尽管脊神经结扎后5-HT能神经元的数量减少，但剩余的5-HT能神经元可能介导下行易化作用［27］。因此，可以推断来自RVM的5-HT可能通过作用于脊髓的5-HT3受体加剧疼痛超敏反应。

Figure 4.The effect of NOX2 blocking peptide gp91ds-tat on mechanical allodynia.A：microinjection of gp91ds-tat（50μmol/L in 1 μL，started 30 min before SMIR，once daily for 3 times）prevented the development of mechanical allodynia following SMIR，whereas the same dose of scrambled ds-tat had no effect；B：microinjection of gp91ds-tat（50μmol/L in 1μL，started at day 7 after SMIR，once daily for totally 3 days）had no obvious effect on the already decreased 50%paw withdrawal threshold；C：the location of the guide cannula（the black line indicated the tip of the guide cannula；the red circle indicated the RVM，where drug diffused into，as the injection needle was 1 mm longer than the guide cannula）.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs-1 d；#P＜0.05，##P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIRgroup.图4 RVM内注射NOX2阻断肽gp91ds-tat对SMIR引起的机械痛敏的影响

尽管RVM释放的5-HT在慢性疼痛中的作用已得到很好的阐明，但5-HT释放增加的机制仍不清楚。在本研究中，我们发现SMIR后NOX2在RVM中上调，RVM内预防性给予NOX2阻断肽可缓解机械痛敏并降低RVM和脊髓背角中的5-HT水平；其次，SMIR可导致细胞内核酸氧化产物8-OHdG表达明显增多，而给予NOX2阻断肽可降低RVM内8-OHdG水平。ROS生成增多可对蛋白和DNA产生过氧化作用，并可诱导TNFα/BDNF等炎症介质释放。RVM的神经元可以分成两种类型，一类具有较宽的动作电位，较负的静息膜电位且对μ受体激动剂不敏感，另外一类具有较窄的动作电位，可能伴有自发的放电，细胞膜上表达MOR且对μ阿片受体激动剂产生超级化反应［28］。在正常情况下，阿片类物质部分地通过减少RVM神经元的GABA信息传递，激活下行抑制系统而产生抑制疼痛的作用，然而在炎症状态下，无论是GABA的输入活动还是GABAA受体的性质都会发生改变，引起GABA能抑制性突触传递功能减弱（去抑制），由此可能导致MOR阳性神经元被特异性的激活（即兴奋性增高），并向脊髓释放5-HT，因而导致下行性易化作用［29］。而炎症可通过抑制RVM内GAD67的转录导致神经元的兴奋性过高［30］。因此我们推测在CPSP产生过程中，NOX2激活所释放的ROS可能通过引起RVM内MOR阳性神经元的GABA抑制性突触传递功能减弱，进而导致MOR阳性神经元兴奋性增高，最终易化脊髓的疼痛信息传递，导致CPSP的产生。我们的研究显示，NOX2及ROS的核酸氧化产物8-OHdG不仅存在于RVM的神经元内，也存在于星形胶质细胞及小胶质细胞内。越来越多的证据表明，外周神经损伤［31-32］后激活的神经胶质细胞可以调节神经元的功能。一旦被激活，胶质细胞可以释放一系列促炎介质，包括细胞因子、NO、COX-2等，这将改变神经元的生存环境。因此，虽然下行易化作用是由神经元释放的神经递质所介导的，但SMIR后RVM中胶质细胞的激活可以改变神经元的生存环境，进而导致其释放5-HT增多。预防性阻断NOX2的激活可能通过抑制RVM的ROS生成而显著减轻CPSP的产生，术后阻断NOX2的激活对已经产生的机械痛敏已经没有作用，这时候虽然抑制NOX2不再产生更多的ROS，但已经产生的ROS不能被清除，并且这些已经产生的ROS可以与NOX1、NOX4等产生正反馈，从而继续产生更多的ROS。因此抑制NOX2虽然可能减少ROS的产生，但并不能消除ROS已经产生的作用。而ROS清除剂则可以更彻底地清除ROS并阻断其作用，因而具有一定的止痛作用，但其效果非常短暂，说明之前ROS的累积作用很难被消除。

Figure 5.Preemptive but not postoperative application of gp91ds-tat decreased the level of 5-HT in RVM and spinal dorsal horn（SDH）following SMIR.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs shamgroup；##P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIRgroup.图5 术前或术后给予gp91ds-tat对RVM和脊髓背角内神经递质5-HT含量的影响

Figure 6.The expression of 8-hydroxyguanine（8-OHdG）in RVM after SMIRand the effect of gp91ds-tat microinjection into RVM on 8-OHdG expression.Compared with sham group（A），8-OHdG was increased at 1 d（B）and 7 d（C）after SMIR.The quantification of 8-OHdG positive area in the 3 groups was shown（D）.The 8-OHdG was located in NeuN-labeled neurons（E）and GFAP-labeled astrocytes（F），and to a less extent in OX-42-labeled microglia（G）at 7 d after SMIR.The percentages of 8-OHdG positive cells in neurons，microglia and astrocytes were shown（H）.Compared with scrambled-tat+SMIR group（I），preemptive treatment with gp91ds-tat（J）significantly decreased the expression of 8-OHdGin RVM at 7 d after SMIR.The quantification of 8-OHdGpositive area in gp91ds-tat-and scrambled ds-tat-treated SMIRrats was shown（K）.Mean±SEM.n=3-5.##P＜0.01 vs sham group；**P＜0.01 vs scrambled ds-tat+SMIR group.图6 SMIR后8-OHd G在RVM的表达情况及RVM内给予gp91ds-tat对8-OHdG表达的影响

Figure 7.Microinjection of phenyl-N-tert-butylnitrone（PBN）into RVM transiently depressed the already established mechanical allodynia［von Frey（VF）hair test］.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs saline+SMIR group.图7 SMIR后7 d RVM内注射ROS清除剂PBN可短暂减轻已经产生的机械痛敏

综上所述，以RVM内NOX2-ROS途径为靶点的干预措施可能会成为预防CPSP的重要方法。