干扰海马spastin表达通过抑制突触传递介导小鼠认知功能障碍*

李志坤，祝 玮，王晗婕，郑雪峰，郭国庆，张吉凤

（暨南大学基础医学与公共卫生学院解剖学系，认知与发育障碍神经科学创新实验室，广东广州510632）

SPAST是遗传性痉挛性截瘫（hereditary spastic paraplegia，HSP）的致病基因，约有40%的HSP系由SPAST基因突变所致［1-2］。单纯型HSP患者神经系统的主要病理改变为皮质脊髓束的退行性变，表现为双下肢的痉挛性瘫痪［3］；而复杂型HSP常伴有认知功能异常，包括学习记忆减退和注意力缺陷等不同程度的认知障碍［4-5］。认知功能障碍发生的原因是什么，是否与SPAST编码的spastin蛋白的功能缺失有关？spastin是AAA型ATP酶活性的蛋白，主要功能是把微管切割成短的片段，以释放微管的动力［6］，除了AAA型ATP酶结构域，spastin的N端还具有一个疏水的HR结构域，以及MIT和MTBD结构域，MTBD负责把spastin锚定于微管，而MIT结构域则参与细胞内膜管的形成和物质的转运［7］。我们前期研究显示，spastin的MIT结构域能够与AMPA受体结合，参与谷氨酸能受体的转运［8］，从而改变培养神经元的树突棘可塑性，提示spastin介导的AMPA受体转运功能可能与认知功能障碍有关。为了验证我们的推测，本研究特意干扰小鼠海马部位spastin蛋白的表达，用膜片钳技术检测突触传递的功能，并评估小鼠的行为学表现，借以明确spastin是否参与小鼠认知功能的调控。

材料和方法

1 动物

SPF级C57BL/6小鼠，雄性，4周龄，15～17 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SYXK（辽）2020-0001。分笼饲养，自由饮水食，控制环境温度（24±2）℃，相对湿度（50±10）%，昼夜交替时间为8：00与20：00。动物实验均遵照《中华人民共和国实验动物管理条例》，并通过暨南大学伦理委员会审查批准。

2 主要仪器与试剂

小鼠脑立体定位注射仪（瑞沃德）；微量注射泵（KDscientific）；冰冻切片机CM1860和振动切片机1200s（Leica）；动物实验行为分析系统（Clever Sys Inc）；双极同心圆刺激电极（FHC）；拉制仪P97及Integrated Patch Amplifier（Shutter）；正 置 显 微 镜Eclipse FN1（Nikon）；数字切片扫描仪（Pannoramic）。spastinⅠ抗、GADPHⅠ抗及河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）购 自Sigma；辣 根 过 氧 化 物 酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的Ⅱ抗（ABclonal）；苦毒宁（picrotoxin，PTX）购自Tocris；高尔基染液试剂盒（ZCIBIO）；重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）载 体rAAV-U6-shSpastin-CMVEGFP-pA和rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA（枢密科技有限公司）。

3 主要方法

3.1 实验分组4周龄雄性C57BL/6小鼠60只，体重15～17 g，随机分为实验（sh-Spastin）组和对照（control）组，每组30只。

3.2 海马定向注射参照Keiser等［9］实验室病毒注射方法。首先用异氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠，固定于脑立体定位仪，参照小鼠大脑立体定位图谱确定海马CA1的位置，前囟（bregma）为原点（0，0，0），在bregma后2.4 mm（AP：-2.4 mm），左、各1.6 mm（ML：±1.6 mm），用1 mm直径的颅骨钻小心开骨窗，然后用消毒过的针头轻轻挑开硬脑膜，使用微量注射泵作微量注射，深度为-1.65 mm（DV：-1.65 mm），注射前将微量注射器下降至-1.70 mm并停留1 min，再上抬至-1.65 mm，实验组注射rAAV-U6-shSpastin-CMV-EGFP-pA，对照组注射rAAV-U6-Scramble-CMV-EGFP-pA，注射量为0.3μL，速度为0.03μL/min，注射完毕后继续留针10 min，待病毒充分扩散后缓慢拔出，用骨蜡封闭骨窗，消毒缝合置小鼠于37℃电热毯上至苏醒。

3.3 Western blot参照本实验室Western blot方法［10］。注射病毒载体21 d后，每组随机选取3只小鼠，异氟烷麻醉，将小鼠脑组织浸入配制好的氧饱和冷冻人工脑脊液中修块，去除小脑组织后以横断面为底用瞬间粘合胶固定于振动切片机底座，使用振动切片机获取5～6片300μm厚的含海马区脑片，立即转移至呈冰水混合物的人工脑脊液中，体视显微镜下参照小鼠大脑图谱快速取小鼠海马CA1区于EP管中，并加入细胞裂解液。剪碎脑组织并超声破碎组织，然后低温离心（10 000×g，10 min），取上清进行BCA蛋白定量。10%的SDS-PAGE，转膜后，脱脂奶粉室温封闭1 h后，孵育兔抗spastin多克隆抗体（1∶1 000稀释）和鼠抗GADPH多克隆抗体（1∶5 000稀释）过夜，室温加入HRP标记的Ⅱ抗（1∶5 000稀释），孵育1 h。增强化学发光法显影，全自动凝胶成像系统拍照。用ImageJ分析条带的灰度值，待测蛋白相对表达水平=待测蛋白灰度值/内参蛋白灰度值，GADPH为内参照。

3.4 冰冻切片制备小鼠用异氟烷深度麻醉，冷生理盐水经心脏灌注，4%多聚甲醛固定。开颅取脑后4%多聚甲醛固定过夜。15%、30%蔗糖梯度脱水，Leica冰冻切片机进行连续冠状切片，片厚30μm。

3.5 尼氏染色为确定重组的sh-Spastin腺相关病毒载体的表达范围，在病毒载体注射C57BL/6小鼠海马的CA1区表达21 d后，取冰冻切片进行进行尼氏染色：切好的脑片贴于玻片上晾干过夜，次日经ddH2O洗2 s，5%甲苯胺蓝水溶液处理10 s，ddH2O洗2s，经75%、85%、95%和100%乙醇梯度脱水（各2 min），经二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ（各5 min）进行透明化，中性树脂封片后镜检。

3.6 HE染色按美仑HE染色试剂盒使用说明书方法，取冰冻切片进行脑片贴片后，室温晾干过夜，用ddH2O洗10 s进行水化；苏木精染液染3 min，自来水冲洗10 s；1%盐酸乙醇洗3 s后自来水冲洗10 min；伊红染液染30 s，自来水冲洗30s；经75%、85%、95%和100%乙醇梯度脱水（各2 min）后经二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ（各5 min）透明；中性树脂封片后镜检。

3.7 高尔基染色按高尔基染色试剂盒使用说明书的方法，在注射病毒载体21 d后，用异氟烷深度麻醉处死，取脑组织于4%多聚甲醛液固定48 h，将实验部位（从背侧海马开始到腹侧海马结束）切成2～3 mm厚脑组织块，加入高尔基染色液将脑组织完全浸没，放置阴凉通风处避光处理14 d（每隔3 d更换一次新染液），染色完成后取出脑组织块经15%和30%的蔗糖溶液脱水处理，经浓氨水处理45 min，蒸馏水洗1 min，定影液处理45 min，蒸馏水洗1 min，30%的蔗糖溶液脱水处理2 d，用振动切片机将脑组织切成100μm厚的脑片，贴于明胶玻片晾干后经75%、85%、95%和100%乙醇梯度脱水（各2 min）、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ（各5 min）进行透明，中性树脂封片后用数字切片扫描仪进行全景多层扫描成像。

3.8 新事物认知实验参照Cohen等［11］新事物认知实验方法：将小鼠置于40 cm×60 cm×40 cm无盖的测试箱中，适应5 min后于测试箱内放两个材质、大小、颜色均相同的圆柱体，把小鼠头部朝向圆柱体训练5 min，1 h后将其中一个圆柱体换成同材质同颜色的正方体（边长与圆柱体直径一样），测试5 min，用Topscanlite 3.0软件分析小鼠对新旧物体的嗅探时间与次数。正常小鼠对新物体有明显偏好，表现为嗅探时间与次数显著增加。

3.9 Morris水迷宫实验参照Nunez等［12］的Morris水迷宫实验方法：水迷宫实验分适应、训练、测试、反向训练和反向测试5个阶段。适应阶段：第1天逃生平台（N象限）高出水面1 cm，把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳寻找逃生平台。训练阶段：第2、3天逃生平台位于水面下1 cm，把小鼠面朝池壁放入S象限自由游泳寻找逃生平台，记录逃生潜伏期。测试阶段：将逃生平台撤走，把小鼠从S象限中点放入池中60 s，记录游泳轨迹，分析穿越平台所在象限的次数及持续时间。反向训练阶段：将逃生平台放于E象限正中且位于水面下，测试小鼠分别从W、S的中点及交点放入池中，记录潜伏期。反向测试阶段：待测小鼠从W与S交点放入池中并自由游泳60 s，分析穿越新平台所在象限的次数及在此象限的持续时间。逃生潜伏期反映小鼠的空间学习能力，穿越平台所在象限的次数及持续时间则反映小鼠的空间记忆能力。

3.10 脑片电生理检测参照Guo等［13］脑片电生理记录方法。在rAAV病毒注射后21 d，异氟烷深度麻醉C57BL/6小鼠，用冷冻高糖人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF；含212 mmol/L蔗糖、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L Na2CO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2、1 mmol/L Ca-Cl2、15 mmol/L抗坏血酸钠和3 mmol/L丙酮酸钠）经心脏灌注。打开颅骨，快速取脑转移至预冷的氧饱和高糖ACSF中，振动切片机冠状切片，片厚300 μm，随后转入氧饱和ACSF（含124 mmol/L NaCl、10 mmol/L葡萄糖、26 mmol/L NaHCO3、3 mmol/L KCl、1.25 mmol/L NaH2PO4、3 mmol/L MgCl2和1 mmol/L CaCl2），恒温水浴箱34℃孵育30 min，之后室温孵育1 h备用。在电压钳模式下，首先分别记录微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）和诱发的兴奋性突触后电流（evoked excitatory postsynaptic current，evoked EPSC）；其次通过记录间隔100 ms的配对脉冲刺激产生的EPSC，分析配对脉冲比值（paired pulse ratio，PPR）即后一个刺激的EPSC/前一个刺激的EPSC的振幅比。最后在电流钳模式下，进行群峰电位（population spike，PS）的记录。首先记录一段10 min的基线（群峰电位幅值为最大幅值的30%），然后给高频刺激（high-frequency stimulation，HFS；4个100 Hz的串刺激，间隔10 s），接着以1/15 Hz的频率给予测试刺激记录40 min以上的群峰电位，诱发长时程增强（long-term potentiation，LTP；群峰电位幅值超过基础电位的20%并能够维持至少30 min）。

4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示，组与组之间的比较用t检验。以P＜0.05作为差异性检验水平。

结 果

1 sh-Spastin可有效抑制小鼠海马spastin的表达

图1A显示，经过尼氏染色的小鼠脑切片，其海马部位的细胞带清晰可见，CA1区细胞带周围均可见绿色荧光，说明病毒载体的注射位置正确，并且均在海马CA1区正常表达。

HE染色显示，实验组海马的组织学结构与对照组相比无显著变化，见图1B；同时实验组和对照组小鼠的体重也无显著差异，见图1C。这说明干扰spastin的表达对海马神经元的形态以及小鼠的生长发育均没有影响。

Western blot结果显示，实验组海马组织中spastin蛋白的表达显著低于对照组（P＜0.05），说明sh-Spastin可有效干扰海马spastin蛋白的表达，见图1D、E。

Figure 1.The expression of spastin in hippocampus CA1 area was knocked down by sh-Spastin.A：representative schematic diagram of stereotactic injection（21 d after rAAV injection，×200）；B：HEstaining showed that spastin knockdown did not change the structure of hippocampus（×200）；C：the body weight of mice after injection of rAAV for 21 d（n=17）；D and E：the protein level of spastin in hippocampuswas detected by Western blot（n=3）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.图1 sh-Spastin敲减海马CA1区spastin的表达

2 干扰海马spastin表达导致小鼠认知功能障碍

新事物认知实验的结果显示，训练阶段对照组小鼠对两相同物体嗅探次数的差异无统计学意义（左侧31.5±2.7，右侧32.5±1.3，P＞0.05），嗅探时间的差异亦无统计学意义［左侧（30.7±3.7）s，右侧（31.7±4.6）s，P＞0.05］，实验组小鼠对两相同物体嗅探次数的差异无统计学意义（左侧25.4±2.5，右侧23.5±2.1，P＞0.05），嗅探时间的差异亦无统计学意义［左 侧（23.2±2.7）s，右 侧（21.0±2.3）s，P＞0.05］；而测试阶段对照组小鼠对新物体的嗅探次数显著多于旧物体（新物体38.6±1.6，旧物体25.5±2.0，P＜0.05），对新物体的嗅探时间也显著长于旧物体［新物体（40.5±2.2）s，旧物体（21.8±2.5）s，P＜0.05］，实验组小鼠对新旧物体嗅探次数的差异无统计学意义（新物体17.1±1.6，旧物体15.5±1.8，P＞0.05），嗅探时间的差异也无统计学意义［新物体（25.4±2.2）s，旧 物 体（22.4±2.6）s，P＞0.05］，见图2。

Figure 2.Spastin knockdown in hippocampus reduced the preference of the mice for novel object.A：schematic diagram of novel object recognition（NOR）test；B：tracks of mice in different stages of NOR test；Cand D：the sniffing times and time of the mice for objects in training and testing stages，respectively.Mean±SEM.n=16.*P＜0.05 vs control group.图2 海马区spastin敲减后小鼠对新奇物体的偏好减少

水迷宫实验的结果显示，对照组和实验组的小鼠在适应阶段均能找到逃生平台。在训练阶段，相比对照组小鼠，实验组小鼠找到逃生平台的潜伏期显著延长［在第2天（D2），对照组（13.0±1.8）s，实验组（20.9±2.6）s，P＜0.05；在第3天（D3），对照组（6.1±0.8）s，实验组（12.7±1.5）s，P＜0.05］，见图3B。在测试阶段，与对照组小鼠相比，实验组小鼠穿越逃生平台所在象限的次数显著减少（对照组8.1±0.8，实验组6.1±0.3，P＜0.05），在逃生平台所在象限持续的时间均显著减少［对照组（17.8±1.2）s，实验组（13.2±0.7）s，P＜0.05］，见图3C～F。当把逃生平台转移至新象限，实验组小鼠找到逃生平台的潜伏期显著增加［在第5天（D5），对照组（6.5±1.0）s，实验组（14.8±3.1）s，P＜0.05］，见图3B。在反向测试阶段，实验组小鼠穿越新平台所在象限的次数显著 减 少（对 照 组8.7±0.8，实 验 组6.0±0.7，P＜0.05），在目标象限持续的时间也显著减少［对照组（22.7±2.0）s，实验组（13.7±0.8）s，P＜0.05］，见图3G～J。

3 干扰海马spastin表达抑制树突棘的成熟

为了明确小鼠认知功能障碍发生的细胞形态变化的基础，我们用高尔基染色观察了海马锥体神经元突起及树突棘的改变。结果显示，干扰海马spastin表达后，锥体神经元树突总长度的差异无统计学意义［对照组（1 048±98）μm，实验组（1 049±64）μm，P＞0.05］，神经元树突分支数目的差异无统计学意义（对照组24.7±3.5，实验组20.1±1.3，P＞0.05），见图4A～C；Sholl分析显示，对照组和实验组神经元树突交叉点数的差异无统计学意义，见图4D。进一步分析树突棘的密度，结果显示，与对照组相比，基树突神经元树突棘的密度显著降低［对照组（9.4±0.5）No./10μm，实 验 组（6.3±0.5）No./10 μm，P＜0.05］，顶树突神经元树突棘密度显著降低［对照组（10.1±0.4）No./10μm，实验组（8.6±0.8）No./10μm，P＜0.05］，见图4E、4F、4H；对树突棘形态进行的分析显示，与对照组相比，基树突成熟的树突棘密度显著降低［对照组（3.7±0.5）No./10μm，实验组（2.2±0.3）No./10μm，P＜0.05］，顶树突成熟的树突棘密度也显著降低［对照组（4.9±0.5）No./10μm，sh-Spastin：（3.4±0.4）No./10μm，P＜0.05］，见图4G、I。

Figure 3.Spastin knockdown in hippocampus led to impaired spatial memory of the mice.A：flow chart of Morris water maze test；B：line graph of escape latency of mice；Cand G：tracks of mice swimming in probe and reversal probe stages；D，E，F，H，I and J：target quadrant crossovers，target quadrant duration and velocity in probe and reversal probe stages.Mean±SEM.n=11-17.*P＜0.05 vs control group.图3 海马区spastin敲减后小鼠空间记忆能力下降

4 干扰海马spastin的表达后突触传递受损

全细胞膜片钳记录mEPSC的结果显示，与对照组相比，实验组小鼠CA1区锥体细胞mEPSC的振幅显著降低［对照组（15.4±1.0）pA，实验组（8.4±0.5）pA，P＜0.05］，频率亦显著降低［对照组（1.3±0.1）Hz，实验组（0.5±0.1）Hz，P＜0.05］，见图5A～C。全细胞膜片钳记录evoked EPSC的结果显示，与对照组相比，evoked EPSC的最大振幅显著降低［对照组（806±28）pA，实验组（476±15）pA，P＜0.05］，见图5D、E。PPR结果显示，实验组与对照组之间PPR差异无统计学意义（对照组1.72±0.12，实验组1.66±0.03，P＞0.05），见图5F、G。

为了进一步检测突触传递效能是否受损，我们在海马切片上检测了小鼠海马CA1锥体神经元的PS，以评估LTP是否受到影响。图6A显示了LTP检测过程中PS记录示意图。高频刺激后，对照组和实验组海马区均能被诱导产生LTP，实验组LTP的水平显著低于对照组（P＜0.05），见图6B、C；LTP初始阶段（高频刺激后0～10 min），实验组PS的幅度与对照组相比显著降低［对照组（176±9）%，实验组（124±5）%，P＜0.05］；在LTP的维持阶段（高频刺激后30～40 min），PS的幅度也显著降低［对照组（166±6）%，实验组（117±2）%，P＜0.05］，见图6D。

讨 论

本实验通过小鼠大脑立体定位注射spastin干扰病毒敲减海马spastin的表达，在不影响小鼠自身生长发育的情况下，分析神经元树突棘发育异常及其失功能是否参与认知功能障碍。实验首先明确了海马CA1区干扰spastin的表达后，可导致小鼠认知功能障碍，表现为海马spastin敲减的小鼠对新事物的偏好降低，空间学习记忆能力下降；然后通过形态学分析检测到海马锥体细胞树突棘缺失，同时成熟的树突棘数量减少。进一步用脑片电生理技术记录到海马的突触传递功能发生障碍，从而明确了干扰spastin的表达系通过抑制突触传递而介导小鼠认知功能障碍。

编码spastin蛋白的SPAST基因突变是导致HSP的重要原因［1-2］，HSP患者主要表现为双下肢的运动功能障碍，然而复杂型HSP除运动障碍外，往往还伴随着认知功能异常，如注意力、学习记忆能力下降等［4-5］。影像学的资料显示，HSP患者大脑出现皮质萎缩、白质变薄和脱髓鞘等病变［14-16］，提示SPAST基因突变通过影响中枢神经系统导致患者认知功能障碍。SPAST全基因敲除的小鼠不仅表现为运动功能障碍，而且工作记忆和联想记忆受损［17］，为了明确HSP认知功能障碍是否由于与学习记忆相关的重要脑区——海马区域的失功能造成的，在本研究中我们特异性的干扰小鼠海马区spastin的表达，结果显示spastin敲减的小鼠新旧物体的识别能力和空间学习记忆能力均降低，从而明确了HSP认知功能障碍受海马区spastin功能的调控。

Figure 5.Spastin knockdown in hippocampus inhibited the function of synapse.A：representative traces of mEPSC for 1 s and 10 s（left）and average traces of mEPSC（right）；Band C：cumulative probability distribution plots of amplitude and inter-event intervals of mEPSC（the bar charts inside indicated amplitude and frequency of mEPSC；n=7-11）；D and E：representative recording of evoked EPSCand input-output curves（n=7-9）；F and G：representative recording of paired pulse ratio（PPR）and bar chart of PPR（n=6-8）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.图5 海马区spastin敲减后突触功能受到抑制

作为一种微管切割蛋白，spastin主要通过其AAA结构域行使微管切割、释放微管动力末端的功能，从而改变神经元突起的形成［6］。细胞水平的研究显示，过表达spastin促进突起分支的形成，提高树突野的复杂性，而干扰spastin则抑制突起分支形成并降低树突野的复杂性［18］。我们在体用病毒注射敲减小鼠海马spastin后，并没有观察到树突长度和分支的改变，而观察到位于树突表面的树突棘的密度显著降低，尤其是成熟树突棘的密度降低最为显著。树突棘作为兴奋性神经元的突触后组份，在突触传递和可塑性中扮演着重要的角色。临床上诸多神经精神性疾病所致的认知功能障碍，比如阿尔茨海默病、精神分裂症、自闭症和抑郁症等［18-20］，都集中体现在树突棘结构和功能的改变上［21］。我们通过脑片电生理记录到mEPSC幅度和频率在spastin敲减后显著降低，说明敲减spastin不仅造成了树突棘结构的改变也同时影响了树突棘的功能。前期我们的研究也发现过表达spastin可明显增加离体培养神经元mEPSC的频率和幅度［18］，这充分说明了spastin可通过改变树突棘可塑性参与认知功能的调控。此外，spastin改变树突棘可塑性可能与AMPA受体的转运相关，AMPA受体是树突棘表面重要的离子型谷氨酸受体，介导了90%以上的兴奋性突触后电流，研究显示spastin的MIT结构域与AMPA受体亚单位存在直接相互作用，而且过表达spastin可促进AMPA受体GluA2亚单位在树突表面的表达［18］。虽然spastin主要功能是切割微管，然而其MIT结构域还参与细胞内膜结构的形成以及物质的转运［22］，提示spastin有可能通过促进AMPA受体转运改变树突棘的结构和功能，这有待我们后续进一步的研究。

Figure 6.Spastin knockdown inhibited CA3-CA1 LTP in hippocampus.A：schematic diagram of population spike（PS）recording；B：representative recordings of PSbefore（Pre）and after（Post）high-frequency stimulation（HFS）；C：changes of PSamplitude（%of baseline）after a HFS，measured from control（7 cells，7 mice）or sh-Spastin（6 cells，6 mice）groups；D：PSamplitude（%of baseline）0 min to 10 min and 30 min to 40 min after HFS（n=10）.Mean±SEM.*P＜0.05 vs control group.图6 敲减spastin后海马区CA3-CA1突触LTP被抑制

突触传递的LTP是反应学习记忆等认知功能的重要指标［23］，无论何种原因造成的树突棘结构和功能的改变，需最终体现在突触传递可塑性的变化上。我们实验中记录的LTP的结果显示，干扰spastin的表达后，诱导出的LTP的幅度较对照组显著降低，说明敲减spastin后树突棘结构和功能的改变进一步造成了突触传递效能的减弱，从而导致了小鼠认知功能障碍的发生。

综合我们的结果，虽然spastin的主要功能是切割微管，然而缺失spastin改变了树突棘的形态结构，而导致突触传递功能受损，从而引起学习记忆等认知功能障碍，缺失spastin所致的突触传递功能受损可能是HSP患者出现认知功能障碍的原因。