益肾通络方对大鼠勃起功能障碍及NO-cGMP通路的影响*

李 勋，陈建设，门 波，李 晖，陈 翔，张 辉，郝高利，樊立鹏，董亚洲

［河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）生殖男科，河南郑州450002］

勃起功能障碍（erectiledysfunction，ED）是一种常见的男性性功能障碍疾病，患者阴茎不能持续达到或维持足够的勃起硬度以完成满意的性生活，近年来其发病率呈现逐年升高的趋势，不仅影响男性生育能力，也极大威胁其心理及精神健康［1-2］。一氧化氮-环磷酸鸟苷（nitric oxide-cyclic guanosine momophosphate，NO-cGMP）通路是调控阴茎勃起的主要信号，NO作为产生和维持阴茎勃起的关键神经递质，由一氧化氮合成酶（nitric oxidesynthetase，NOS）在催化下生成，当其生成减少时，cGMP水平降低，血液进入阴茎动脉和海绵窦间隙受阻，从而抑制阴茎的勃起；激活NO-cGMP信号通路，则可改善ED临床症状［2-4］。ED在中医理论中属于“阳痿”，肾阳亏虚、血瘀脉络是其主要病机，补肾壮阳、活血通络是ED主要的治疗手段［5］。益肾通络方（Yishentongluo decoction，YSTL）是治疗男性不育的经验方，可温肾助阳、益气活血、散结通络，抑制生精细胞凋亡，提高精索静脉曲张不育症患者生精能力，并对肝郁肾虚型ED患者临床疗效显著［6-7］。但益肾通络方对ED大鼠NO-cGMP通路的影响目前还不清楚，本文通过建立ED大鼠模型，对此进行探索。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物健康雄性SD大鼠，许可证号为SYXK（粤）2018-0193，深圳康泰生物制品股份有限公司，体重200～240 g。饲养条件：12 h/12 h交替光暗，温度25℃，湿度55%左右，大鼠自由饮食、饮水，动物房环境保持安静、通风良好。

1.2 试剂与仪器益肾通络方（丹参30 g、淫羊藿20 g、菟丝子20 g、黄芪20 g、川牛膝10 g、熟地黄10 g和水蛭6 g为1剂）购自康仁堂药业有限公司；己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）购自Sigma；西地那非（sildenafil）片（国药准字：H20020526）购自美国辉瑞公司；阿扑吗啡购自湖北科益药业股份有限公司；睾酮放射免疫测定试剂盒购自天津协和医药科技集团有限公司；大鼠cGMPELISA试剂盒，兔源抗NOS、鸟苷酸环化酶（guanosine cyclase，GC）和GAPDH的Ⅰ抗，以及羊抗兔Ⅱ抗购自Abcam；NOSELISA试剂盒购自上海远慕生物科技有限公司；NOELISA试剂盒购自潍坊祺翔生物科技有限公司；RIPA裂解液和BCA试剂盒购自碧云天。ELx800酶标仪购自Bio-Rad；MP150生理仪购自BIOPAC；H6080放免仪购自Carl Zeiss；Centrifuge 5424R低温高速离心机购自Eppendorf；1659001蛋白电泳仪和Trans-Blot Turbo转膜仪购自Bio-Rad；GIS-500凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司。

2 方法

2.1 大鼠模型制备及分组给药取SD大鼠，将DES溶于生理盐水中，以5 mg/kg［8］腹腔注射，每天1次，连续注射8周后，检测大鼠血清睾酮水平，并进行阿扑吗啡诱导勃起实验，当大鼠血清睾酮水平（71.08±9.86）相比对照组大鼠（335.17±30.12）明显降低，且在30 min内勃起次数为0时，表明建模成功，共建模63只，成功60只，随机分为模型（model）组、益肾通络方低（YSTL-low）、中（YSTL-medium）、高（YSTL-high）剂量组和西地那非（sildenafil）组，每组12只，另取12只SD大鼠，腹腔注射等剂量生理盐水，设定为对照组。取益肾通络方2剂，加水煎煮，过滤得到生药浓度为2.32 g/mL的药液100 mL，以生理盐水稀释，获得浓度为0.58、1.16和2.32 g/mL的药液，益肾通络方各剂量组以10 mL/kg［9］灌胃，使终剂量分别为5.8、11.6和23.2 g/kg，西地那非溶于生理盐水中，制备为0.5 mg/mL的溶液，以10 mL/kg的剂量［10］灌胃，使终剂量为5 g/kg，模型组和对照组以10 mL/kg的生理盐水灌胃，每天1次，连续用药4周。

2.2 阿扑吗啡诱导勃起实验以阿扑吗啡试验检测大鼠勃起功能［11］：末次给药24 h后，将大鼠放置在安静、昏暗的环境下进行。实验开始前，先让动物适应室内环境1 h，于颈部皮下注射阿扑吗啡，剂量为100 μg/kg，然后观察大鼠阴茎勃起情况，记录30 min内勃起次数及勃起潜伏期，取其平均值。阴茎勃起标志：大鼠龟头充血、阴茎体增长并露出，有时伴有射精、弯腰舔食阴茎及打哈欠等动作。勃起潜伏期：从阿扑吗啡注射结束至大鼠出现第1次阴茎勃起之间所用的时间，若30 min内大鼠未勃起，则勃起潜伏期为30 min。

2.3 大鼠最大阴茎海绵体内压（maximum intracavernous pressure，Max ICP）/平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）的检测勃起实验结束后，大鼠禁食12 h，通过电刺激海绵体神经，使阴茎海绵体充血勃起，参数为电流5 mA，频率50 Hz，脉冲宽度61.66 ms，持续60 s，以生理仪连续监测ICP及MAP，计算Max ICP/MAP值。

2.4 大鼠血清睾酮水平、阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平的测定2.3中的检测结束后，各组大鼠经尾静脉取血2 mL，静置后4℃、3 000 r/min离心，取上清液，得到血清备用，然后吸入乙醚麻醉大鼠后处死，分离阴茎组织，剪取约3 g，剪碎后加入蛋白裂解液，以匀浆机制备为匀浆液，4℃、3 000 r/min离心20 min，取上清液，参照试剂盒说明书，以BCA法测定其中蛋白总浓度，血清及蛋白样品液各取500 μL，采用试剂盒分别测定血清中睾酮水平、阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平，操作步骤严格按照说明书进行，剩余蛋白样品液进行蛋白表达检测。

2.5 大鼠阴茎组织中NOS和GC蛋白表达的测定各组分别取含20μg总蛋白的2.4中剩余的样品液，上样，进行电泳，然后湿转，将分离蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经5%牛奶溶液封闭后（室温孵育2 h），分别以兔源抗GAPDH、NOS、GC的Ⅰ抗溶液孵育过夜（4℃），稀释比例均为1∶2 000，TBST溶液漂洗3次，以稀释比例为1∶1 000的羊抗兔Ⅱ抗溶液孵育2 h（室温），TBST溶液漂洗3次，以增强化学发光法显影，使用凝胶成像仪对条带拍照，并采用ImageJ软件分析图像，得出蛋白相对表达量。

3 统计学处理

采用SPSS 24.0软件进行统计分析。数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较行SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 益肾通络方对大鼠勃起功能的影响

与对照组比较，模型组大鼠勃起次数明显降低（P＜0.05），勃起潜伏期明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，益肾通络方低、中、高剂量组和西地那非组大鼠勃起次数升高（P＜0.05），勃起潜伏期降低（P＜0.05），且益肾通络方各组之间呈剂量依赖性（P＜0.05）；益肾通络方高剂量组与西地那非组相比差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠勃起功能、Max ICP/MAP和血清睾酮水平的变化Table 1.Erectile function，Max ICP/MAPand serum testosterone levels in each group（Mean±SD.n=12）

2 益肾通络方对大鼠Max ICP/MAP的影响

与对照组比较，模型组大鼠Max ICP/MAP明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，益肾通络方低、中、高剂量组和西地那非组大鼠Max ICP/MAP升高（P＜0.05），且益肾通络方各组之间呈剂量依赖性（P＜0.05）；益肾通络方高剂量组与西地那非组相比差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

3 益肾通络方对大鼠血清睾酮的影响

与对照组比较，模型组大鼠血清睾酮水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，益肾通络方低、中、高剂量组和西地那非组大鼠血清睾酮水平升高（P＜0.05），且益肾通络方各组之间呈剂量依赖性（P＜0.05）；益肾通络方高剂量组与西地那非组相比差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

4 益肾通络方对大鼠阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平的影响

与对照组比较，模型组大鼠阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，益肾通络方低、中、高剂量组和西地那非组大鼠阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平升高（P＜0.05），且益肾通络方各组之间呈剂量依赖性（P＜0.05）；益肾通络方高剂量组与西地那非组相比差异无统计学显著性（P＞0.05），见表2。

5 益肾通络方对大鼠阴茎组织中NO-cGMP通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠阴茎组织中NOcGMP通路相关蛋白NOS和GC蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，益肾通络方低、中、高剂量组和西地那非组大鼠阴茎组织中NOS和GC蛋白表达水平升高（P＜0.05），且益肾通络方各组之间呈剂量依赖性（P＜0.05）；益肾通络方高剂量组与西地那非组相比差异无统计学显著性（P＞0.05），见图1、表2。

讨 论

ED的病因复杂多样，生理及心理等多方面因素涉及其中，睾酮水平低下是其主要病因之一，肢端肥大症、甲状腺疾病、垂体功能减退等均可影响性腺功能，减少睾酮生成，继而引发ED，DES作为一种非甾体合成雌激素，可破坏睾丸引带细胞的形态，抑制其增殖，损伤男性生殖系统功能，可用来构建ED动物模型［8，12-14］。本文通过腹腔注射DES的方法建立ED大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组大鼠勃起次数、Max ICP/MAP、血清睾酮水平明显降低，勃起潜伏期明显升高，表明DES可影响睾酮合成，降低其血清水平，损伤大鼠阴茎勃起功能，造成ED，揭示模型建立成功。

表2 各组大鼠阴茎组织中NOS活性、NO/cGMP含量和NOS/GC蛋白水平的变化Table 2.NOSactivity，NO/cGMPcontent and NOS/GCprotein levels in penile tissue in each group（Mean±SD.n=12）

Figure 1.The expression of NO-cGMPpathway-related proteins in penile tissue of rats in each group was determined by Western blot.A：control group；B：model group；C：YSTL-low group；D：YSTL-medium group；E：YSTL-high group；F：sildenafil group.图1 Western blot检测各组大鼠阴茎组织中NO-cGMP通路相关蛋白的表达

临床治疗ED以对症治疗为主，药物常采用磷酸二酯酶抑制剂，西地那非作为一种选择性磷酸二酯酶抑制剂，在临床中得到广泛应用，但其对部分患者疗效不佳，并且存在较多副作用，中医药治疗可标本兼治，其毒副作用小，具有明显优势［7，15-16］。中医学认为，ED即为“阳痿”，肾藏精，内寓真阳，主生殖，是先天为之本，若元阳亏损，肾精不足，可导致推动和滋养不足，精血运行受阻，瘀血积聚，因而肾精亏损为本，血瘀阻络是标，是ED的重要病机。益肾通络方是治疗肾精亏虚的经典方剂，方中川牛膝、丹参能通络活血，淫羊藿能补助肾阳，菟丝子能填精益肾，黄芪能升阳补气，熟地黄能补髓生精，水蛭能通经化瘀，诸药合用具有补肾生精，化瘀通络的功效，对男性不育症、性功能障碍等疾病具有较好的疗效［17-19］。本文结果显示，以益肾通络方处理ED模型大鼠，可升高大鼠勃起次数、Max ICP/MAP、血清睾酮水平，降低勃起潜伏期，且呈剂量依赖性，表明益肾通络方可增强睾酮合成，促使血液进入阴茎动脉和海绵窦间隙，升高阴茎海绵体内压，改善阴茎勃起功能，进一步证实益肾通络方对ED具有治疗作用，但其药理机制目前还不清楚。

研究证明，NO-cGMP通路在引起并维持阴茎勃起中起到关键的调控作用，NO作为一种内源性信号分子，由NOS催化产生，可通过激活GC，把GTP转化为cGMP，作用于钙离子通道，松弛平滑肌，促使血液进入阴茎动脉和海绵窦间隙，引起阴茎勃起［3-4］。另外，研究发现促进睾酮合成，可激活NO-cGMP信号，增加血清NO含量，显著改善ED男性性功能，由此可知NO-cGMP是调控睾酮水平，改善ED临床症状的重要作用靶点［20-21］。本文结果显示，ED模型大鼠阴茎组织中NOS活性及NO、cGMP水平、阴茎组织NOS和GC蛋白表达明显降低，经益肾通络方治疗后，其阴茎组织中NOS活性及NO和cGMP水平、阴茎组织NOS和GC蛋白表达升高，且呈剂量依赖性，表明NO-cGMP信号参与睾酮合成的调控及ED的发病过程，益肾通络方可活化该信号通路，增强睾酮的合成，改善ED症状。

综上所述，益肾通络方可上调NOS和GC蛋白表达，提高阴茎组织中NO和cGMP水平，增强睾酮合成，促使血液流入阴茎，升高阴茎海绵体内压，修复阴茎勃起功能，激活NO-cGMP信号可能是其药理机制。但本文只进行了初步研究，证据还不充足，需以NOcGMP通路激动剂和抑制剂做对照验证，进而对益肾通络方治疗ED的药理机制进行充分深入的阐释。