miR-155/自噬/外泌体对酒精性肝病的影响*

陈思龙，徐光福，覃诗雨，肖 莉

（三峡大学医学院，湖北宜昌443002）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期过度饮酒导致的一种慢性肝脏损伤性疾病，其发病率在全球逐年增高［1］，在中国已成为继病毒感染之后的第二大肝损伤原因。ALD可表现为一系列的病理变化，包括脂肪变性，肝炎、肝纤维化和硬化，甚至导致肝癌的发生［2］。由于其病理机制复杂，目前尚无有效的临床治疗手段和药物［3］。深入探讨ALD的病理机制，具有重要的科学研究意义和临床应用前景。

肝脏巨噬细胞（即kupffer细胞）的持续过度活化对诱导和推动ALD具有举足轻重的作用［4］。以巨噬细胞为靶点，抑制ALD中肝脏过度的炎症反应被认为是治疗ALD的重要研究方向［5］。基于肠源性内毒素激活肝内巨噬细胞的作用［6］，使用肠道抗生素和益生菌等［7-8］也对ALD具有一定的治疗作用。近年来的研究显示，外泌体可直接激活ALD中肝脏巨噬细胞，是巨噬细胞过度活化的重要因素［9-10］。但酒精诱导肝脏外泌体生成的相关调节机制仍不明确。

近年来的研究显示，自噬和外泌体相关分泌途径之间密切相关［11］。它们共享了许多相同的因素，例如外泌体来源于多泡小体（multivesicular bodies，MVB），自噬体也可以与晚期内囊体或MVB融合，产生自噬内涵体［12］。在外泌体实验中也发现了许多参与不同自噬过程的蛋白质，例如HSPA8，HSP90AA 1，VCP和Rab7A等。但在ALD中，自嗜和外泌体生成关系尚不明确。本实验以“miR-155/自噬/外泌体”为主要研究对象，从肝细胞对巨噬细胞活化作用的角度，探讨酒精性肝病的病理机制，为药物治疗靶点的开发提供实验基础。

材料和方法

1 动物和细胞

8～10周龄雌性C57BL/6N小鼠购自三峡大学实验动物中心（合格证号：No.42010200002783）。所有动物实验均经三峡大学动物保护和使用委员会批准，按照国家卫生研究院的指导方针进行。小鼠正常肝细胞AML-12购于ATCC（货号CRL-2254）。

2 主要试剂

Lieber-DeCarli酒精液体饲料购于南通营养动物饲料高科技有限公司（货号TP4030D、TP4030C）；ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit（货号EQ806A-1）和去外泌体胎牛血清（货号EXOFBSHI）购自System Biosciences；兔抗鼠CD63抗体（货 号DF2305）购 自Affinity Biosciences；佛 波 酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA；货号P1585）和PKH26（货号MINI26）购于Sigma Aldrich。

3 主要方法

3.1 动物实验将C57BL/6N小鼠随机分为饮食对照（control）组和酒精喂养（ethanol）组，单笼喂养，并将饮食对照组和酒精喂养组小鼠进行等热量配对喂养［13］，每组10只。酒精饮食的小鼠以含有5%（v/v）乙醇的Lieber-DeCarli液体饲料喂养6周；配对饮食小鼠每日喂饲与酒精饮食小鼠相等热量的液体饲料。实验结束时，收集血浆和组织样本。

3.2 细胞培养AML-12细胞在37°C、5%CO2环境中培养在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM；Gibco）中，添加1×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素和10%去外泌体胎牛血清中。当细胞融合度达到70%～80%时，加入250 mmol/L乙醇培养24 h以诱导细胞损伤。

THP-1细胞在RPMI-1640完全培养基中培养，经PMA（5μg/L）刺激12 h，形成PMA分化的THP-1细胞（简称dpTHP-1细胞）。将来源于AML-12细胞的外泌体（28μg/L）与pdTHP-1细胞共培养24 h，收集细胞，检测相关细胞因子mRNA的表达。

3.3 外泌体的分离与鉴定收集细胞培养基，根据说明书进行外泌体分离（ExoQuick Exosome isolation and RNA Purification Kit）。简单地说，将10 mL培养基与2 mL ExoQuick外泌体沉淀溶液在4℃下混合过夜，然后在1 500×g下离心30 min，取上清液，得到富含外泌体的部分。将外泌体洗涤2次并重新悬浮在PBS中并在-80℃下储存。通过透射电镜和纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）技术对外泌体的大小、浓度和表面标记物进行了表征。利用NanoSight NS300系统（NanoSight，Amesbury）分析外泌体的浓度和大小分布。每个样品测量3次。

3.4 组织染色4%中性甲醛固定的肝组织常规制作成石蜡切片或冰冻切片，进行HE染色或油红染色后显微镜下观察。石蜡切片在进行抗原修复后，与5%山羊血清/0.3%吐温-20/PBS非特异性结合，并与兔抗鼠CD63抗体（1∶100）在4℃下孵育过夜。洗涤后，用Cy3结合山羊抗兔IgG在室温下黑暗中孵育1h。经DAPI核染色后，在Olympus BX53显微镜下观察，用IPP6.0软件进行强度测定。

3.5 显微镜检查用荧光染料PKH26（Sigma）标记肝细胞外泌体，与pdTHP-1细胞在28μg/L的终浓度下孵育12 h，在Olympus BX53显微镜下观察细胞摄取外泌体的情况，并用Cell Sense软件采集图像。

3.6 ELISA和生化分析肝组织匀浆（50 g/L）于RIPA缓冲液（含PMSF）中。采用标准化全自动生化分析仪（Rayto）测定血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性、甘油三酯（triglyceride，TG）和肝脏总胆固醇（total cholesterol，TC）的水平。为了便于分析，所有小于检测下限的值都被认为是零。

3.7 Western blot分析肝组织或AML-12细胞使用含PMSF的RIPA缓冲液匀浆，提取总蛋白。等量的蛋白质行SDS-PAGE，并转移到硝酸纤维素膜上，使用抗LAMP-1和LAMP-2抗体（1∶300；Proteintech）进行Western blot（Bio-Rad公司）检测。蛋白质条带扫描后用ImageJ软件，以GAPDH为内参照进行分析定量。

3.8 RT-qPCR按RNAiso plus试剂盒说明书使用Trizol从小鼠肝组织样本或AML-12细胞中分离出总RNA，PrimeScript™RTreagent Kit（TaKaRa）进行反向转录，扩增cDNA。以GAPDH mRNA或U6的表达为标准，用2-ΔΔCt法计算相对mRNA的表达。其中主要使用的引物序列见表1。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析及作图。实验数据以均数±标准差（mean±SD）表示，对组间差异进行t检验（Dunnett-t），以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 慢性酒精摄入导致肝脏损伤

液体酒精饲料喂养C57BL/6N小鼠6周，建立小鼠慢性ALD模型。组织学观察发现，酒精性饲料导致小鼠肝细胞空泡变性、肝组织的脂质沉积和炎症细胞浸润（图1A、1B）。与配对喂养小鼠相比，喂养酒精的小鼠血清ALT活性显著升高（P＜0.05，图1C），肝脏组织甘油三酯的含量增加（P＜0.01，图1D）。这些结果表明，慢性酒精导致了肝脏损伤。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The primer sequences used for RT-qPCR

Figure 1.The liver injury in ALD mice.A：HE staining（×200）；B：Oil red O staining（×200）；C：serum ALT activity；D：TG content in liver.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.图1 ALD小鼠肝脏损伤情况的观察

2 慢性酒精摄入诱导肝脏过度的炎症反应

炎症反应被认为在ALD的发病机制中起着至关重要的作用［14］。我们检测了肝脏组织炎症因子的表达，结果发现，酒精喂养小鼠肝脏TNF-α、IL-1β、NOS-2、F4/80和MCP-1的mRNA表达显著增加（P＜0.05）。这说明，慢性酒精的摄入可诱导巨噬细胞的过度活化和肝脏炎症反应的增强。见图2。

Figure 2.Excessive inflammatory responses in the liver of ALD mice.Relative mRNA expression of TNF-α，IL-1β，NOS-2，F4/80 and MCP-1 in the liver was detected by RT-qPCR.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.图2 ALD小鼠肝脏中发生过度的炎症反应

3 慢性酒精摄入对小鼠肝脏miR-155/自噬/外泌体的影响

细胞外囊泡的传递可以介导细胞之间的通讯［15］。我们发现，与配对饮食组相比，酒精饮食喂养小鼠肝脏CD63（外泌体标志蛋白）的表达显著增加（图3A）。在ALD中，酒精诱导肝细胞分泌大量的细胞外囊泡，含有高浓度的CD40L，能直接激活肝脏巨噬细胞［16］。进一步的结果显示，酒精的暴露明显地提高了小鼠肝脏CD40L的表达（图3B）。

近年来的研究表明，细胞外泌体的生成与自噬密切相关。我们检测肝脏自噬相关蛋白，结果表明，与配对饮食组相比，酒精饮食喂养小鼠肝脏溶酶体相关膜蛋白LAMP1和LAMP2的表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），提示酒精会损害肝脏细胞的自噬程序（图3C）。此外，慢性酒精的摄入可导致肝脏miR-155的表达显著升高（P＜0.01图3D）。这些结果提示，酒精可诱导肝脏miR-155的表达，抑制肝细胞自噬，促进肝细胞外泌体的生成，外泌体可直接介导肝脏巨噬细胞的活化。

4 乙醇通过升高AML-12细胞中miR-155的表达导致细胞自噬受损

为了进一步明确酒精对肝细胞的作用，我们使用乙醇刺激AML-12细胞24 h，制备酒精损伤肝细胞体外模型。结果表明，酒精可直接诱导AML-12细胞的miR-155表 达 的 升 高（P＜0.05，图4A），降 低LAMP1和LAMP2的 表 达（P＜0.05，P＜0.01，图4B）。

5 乙醇诱导AML-12细胞分泌的外泌体直接介导巨噬细胞的活化

为了明确酒精作用下肝细胞对巨噬细胞的免疫调节作用，我们将AML-12细胞暴露于乙醇中24 h，分离纯化细胞外囊泡，电镜观察显示其膜性结构和大小（图5A）。经NAT分析表明，细胞囊泡的大小在100～150 nm之间，说明其大部分为外泌体（图5B）。与对照组相比，酒精显著升高了AML-12细胞外泌体的分泌数量（P＜0.05，图5C）。

我们将AML-12细胞分泌的外泌体和pdTHP-1细胞共培养，研究外泌体对巨噬细胞的免疫调节作用。结果发现共培养6 h后，就可以观察到pdTHP-1细胞摄取外泌体的现象（图5D）。乙醇处理组外泌体刺激pdTHP-1细胞12 h后，细胞内TNF-α和IL-1β的mRNA表达显著增加，IL-10和CD206的mRNA表达没有明显变化（图5E），提示向M1型巨噬细胞活化的趋势。然而，来自对照组的外泌体对pdTHP-1细胞的细胞因子表达没有明显的改变。

Figure 3.The changes of miR-155-mediated autophagy/exosome expression in ALD mouse liver.A：the expression of CD63 in the liver tissue；B：CD40L in the liver tissue；C：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2 in the liver tissue；D：miR-155 in the liver tissue.PF：paired feed group；AF：alcohol feed group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PFgroup.图3 miR-155介导的自噬/外泌体轴在ALD小鼠肝脏中的表达

Figure 4.Ethanol induced impairment of autophagy in AML-12 cells.A：relative expression of miR-155；B：relative protein levels of LAMP1 and LAMP2.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图4 乙醇导致AML-12细胞自噬功能受损

讨 论

酒精可诱导肝细胞分泌大量外泌体。在ALD患者［17］和动物模型外周血［18］中可发现，外泌体的数量显著升高。在体外使用酒精刺激肝细胞发现，外泌体的生成量成倍增加，而且与巨噬细胞相比，肝细胞是ALD中分泌外泌体的主要细胞［18］。对ALD患者外周血中外泌体的研究表明，外泌体中有多种miRNA，其蛋白质［19］及磷脂［20］等的表达均发生了显著改变。Saha等［21］的实验表明，使用酒精刺激肝细胞产生的细胞外囊泡（主要为外泌体）可通过HSP90介导巨噬细胞的活化。Verma等［16］的实验显示，酒精可诱导肝细胞分泌大量的外泌体，携带36种与炎症相关的蛋白，其中CD40L可直接介导巨噬细胞的活化，加重肝脏的炎症反应。使用CD40L中和抗体可以显著的降低外泌体对巨噬细胞的活化作用。以上研究都说明，来源于肝细胞的外泌体是激活肝内巨噬细胞的重要因素。本实验也显示，酒精的摄入可导致小鼠肝细胞外泌体表达的增高，体外实验表明酒精诱导肝细胞分泌的外泌体可直接介导巨噬细胞的激活。但是酒精诱导肝细胞外泌体合成的机制尚不十分清楚。

Figure 5.Immunomodulatory effect of exosomes secreted by ethanol-stimulated hepatocytes on macrophages.A：the morphological change of extracellular vesicle was observed under electron microscope（×10 000）；B：the size and distribution of extracellular vesicles were detected by nanoparticle tracking analysis；C：the numbers of exosomes（PF：paired feed group；AF：alcohol feed group）；D：the intake of exosomes by THP-1 cells（×200）；E：the mRNA expression of TNF-α，IL-1β，IL-10 and CD206.Control-Ex：control exosome；ethanol-Ex：ethanol-treated exosomes.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs PF group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs control-Ex group.图5 乙醇刺激肝细胞分泌的外泌体对巨噬细胞的免疫调节作用

在酒精性肝损伤中，急性酒精可直接激活肝脏自噬，而慢性酒精的暴露会导致肝脏自噬功能不足，表现为自噬通量受损［22］。慢性酒精摄入时自噬通量的损害与溶酶体功能和生物发生有关。酒精性饲料喂养降低了小鼠肝脏转录因子EB［23］，后者是溶酶体生物发生和自噬的主要调节因子。Babuta［24］等的研究也表明，慢性酒精的摄入启动了肝细胞自噬，但溶酶体功能下调，整体自噬通量是损伤的。同时体外实验也发现，在肝细胞和巨噬细胞中沉默LAMP1和LAMP2基因，可有效提高外泌体的释放。本实验也发现，慢性酒精的摄入可诱导肝细胞外泌体的分泌成倍增加，同时肝细胞LAMP1和LAMP2表达显著降低，说明溶酶体功能损伤，自噬功能被抑制，提示酒精可能通过调节肝细胞自噬中的溶酶体功能，诱导外泌体的生物合成。但是在ALD中，自噬和外泌体的相互关联仍需要进一步探索。

miR-155似乎是参与ALD发生和发展的重要途径的关键miRNA［25］，在肝脏炎症和纤维化中均具有重要的调节作用。ALD患者［26］和实验研究［27］都证明，酒精暴露后不同细胞群的肝脏或外周血miR-155表达显著增加。miR-155在巨噬细胞中的高表达可延长TNF-ɑmRNA的半衰期，介导ALD中肝脂肪变性、炎症和肝细胞死亡［27］。与野生型小鼠相比［28］，酒精喂养后miR-155 KO小鼠肝脏甘油三酯、ALT水平和脂质过氧化水平显著降低，减轻慢性酒精诱导的肝损伤，这意味着靶向调节miR-155可能具有治疗ALD的潜力。已有报道表明miR-155可直接或间接作用于自噬途径的多种基因，包括mTOR，p62，LAMP1和LAMP2等［29-30］，从而调控细胞的自噬过程。本实验结果表明，酒精诱导肝细胞miR-155表达的升高，这可能与肝细胞自噬功能受损与关。

我们的研究表明，酒精刺激肝细胞生成大量miR-155，通过抑制LAMP1和LAMP2的表达导致肝细胞自噬功能障碍，诱导肝细胞生成大量外泌体，外泌体通过其携带的生物分子可直接介导巨噬细胞的活化，引发级联炎症反应，造成肝脏损伤。酒精通过刺激肝脏miR-155介导自噬和外泌体分泌，诱导外泌体及其携带的致炎因子释放的显著增加，也是ALD中肝脏巨噬细胞持续过度激活的重要因素。