异基因骨髓移植小鼠肠道菌群和NLRP3炎症小体改变与急性移植物抗宿主病发生发展的关系*

赵燕娜，汪丽佩，李天一，何志兴，张 婷，温成平

（1浙江中医药大学基础医学院，浙江杭州310053；2浙江中医药大学附属第一医院血液病研究所，浙江杭州310053）

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）近年来已成为治疗白血病和再生障碍性贫血等血液系统疾病的重要方法［1］，但是急性移植物抗宿主病（acute graftversus-host disease，aGVHD）作为主要并发症，却限制了Allo-HSCT的应用［2］。aGVHD的发病机制目前仍未完全阐明，认为它是一个多层面多步骤的病理过程。文献报道［3］，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domainlike receptor protein 3，NLRP3）可活化白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）等细胞因子，是破坏肠道菌群及促发aGVHD的关键环节。本研究观察到aGVHD可引起小鼠外周血抗炎细胞因子IL-4和IL-10水平降低，致炎细胞因子IL-1β和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）显著增高，下调肠紧密连接蛋白之一的闭合蛋白（occludin）表达，影响肠道屏障功能，引起肠道菌群结构及靶器官病理学形态改变，并激活NLRP3炎症小体表达，从而形成恶性循环，为肠道菌群和NLRP3炎症小体参与aGVHD的发生机制提供理论依据，并可能为该疾病治疗提供靶点。

材料和方法

1 实验动物和材料

6～8周龄SPF级近交系C57BL/6雄性小鼠为供鼠，6～8周龄SPF级近交系BALB/c雌性小鼠为受鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（沪）2012-0002和SCXK（沪）2013-0016。小鼠均饲养于浙江中医药大学实验动物中心，饲料、垫料和饮用水均经高压灭菌处理。PECD4和FITC-CD8抗体购自BD Pharmingen；小鼠IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α的ELISA试剂盒购于R&D Systems；兔抗紧密连接蛋白闭锁蛋白（occludin）抗体购于Zymed Laboratories；SP免疫组化染色试剂盒购于福州迈新生物技术公司；兔抗小鼠NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和caspase-1抗体购于Abcam。

2 方法

2.1 受鼠准备实验受鼠均饲养于浙江中医药大学实验动物中心SPF级实验室内，于移植前1周饮用含庆大霉素（320 mg/L）的消毒饮用水，预处理行全身照射（total body irradiation，TBI），总剂量13.0 Gy，分两次照射，每隔3 h一次，照射量频为2.0 Gy/min，照射距离为100 cm。

2.2 aGVHD模型的建立及分组移植当天麻醉后颈脱法处死供鼠，无菌条件下分离股骨、胫骨与脾脏，剪去骨骺端并用注射器反复冲洗骨髓腔并过滤收集，脾脏于200目筛网上研磨并收集脾细胞，将上述细胞收集后，裂解红细胞并用PBS洗涤，计数后调整骨髓细胞和脾细胞比例为1∶4并混合。受鼠预处理后4～8 h经尾静脉注射5×106个混合细胞。白细胞数下降后复升且连续3 d超过1×109/L为移植成功，移植后7 d左右出现精神萎靡、进食差、体重下降、耸毛、呈弓背体位等属于aGVHD造模成功，即aGVHD组。同时以未接受移植的SPF级近交系BALB/c雌性小鼠为正常对照（normal）组。

2.3 瑞氏-吉姆萨染色法检测供鼠骨髓细胞收集供鼠骨髓细胞悬液，经离心涂片机71×g离心甩片5 min，制成细胞涂片。常规瑞氏-吉姆萨染色，油镜下放大1 000倍观察细胞形态。

2.4 流式细胞术检测供鼠脾细胞收集供鼠脾细胞，PBS洗涤，分别加入PE标记的CD4和FITC标记的CD8单克隆抗体，室温孵育30 min，PBS洗去未结合的抗体，流式细胞术检测表面标记的阳性细胞率，每个标本检测记录10 000个细胞，DIVA软件作阳性率的分析。

2.5 血清细胞因子的检测在模型组移植后第14天，双抗体夹心ELISA法分别测定正常对照组和aGVHD组小鼠外周血IL-1β、IL-4、IL-10和TNF-α水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

2.6 免疫组化检测回肠组织紧密连接蛋白的表达取回肠组织，进行固定、包埋及切片后，采用常规SP法测定，抗occludin抗体反应总浓度为1：200，阴性对照用PBS代替，每张切片均于镜下观察，细胞中出现棕褐色颗粒判定为阳性表达。

2.7 肠道菌群检测移植后14 d，收集各组小鼠回盲部粪便，立即置于无菌采样盒内，-80℃低温冷冻保存。取200 mg样品采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒（QIAGEN）快速提取和纯化DNA，委托杭州谷禾信息技术有限公司应用16SrDNA基因测序，使用QIIME软件进行测序数据处理并对获得的高质量序列进行分析比对。

2.8 组织病理学检测移植后14 d，处死小鼠，取出肺、肝、脾和回肠组织标本，采用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，行HE染色观察形态病理学变化。

2.9 肠组织NLRP3炎症小体表达的检测处死小鼠后提取小肠（幽门部至回盲部）蛋白，行Western blot分析NLRP3、ASC和caspase-1的表达情况。

3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料实验数据以均数±标准误（mean±SEM）表示，两组之间采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 供鼠骨髓细胞及脾细胞鉴定

冲洗供鼠股骨和胫骨骨髓腔后甩片并进行瑞氏-吉姆萨染色，如图1所示，供鼠骨髓增生活跃，有核细胞量中等，骨髓小粒内细胞丰富。供鼠脾脏于200目筛网上研磨收集，并进行CD4及CD8染色后流式细胞术检测，结果如图2所示，脾细胞中11.6%为CD4+T淋巴细胞，30.1%为CD8+T淋巴细胞。以上结果提示收集到的供鼠细胞为正常骨髓细胞及含有丰富T淋巴细胞的正常脾细胞。

Figure 1.Wright-Giemsa staining（×1 000）of bone marrow（A）and bone marrow particles（B）.图1 骨髓片和骨髓小粒的瑞氏-吉姆萨染色

Figure 2.Detection of CD4+and CD8+T cells from spleen by flow cytometry.图2 流式细胞术检测脾细胞中CD4+及CD8+T细胞

2 aGVHD对细胞因子的影响

与正常对照小鼠比较，aGVHD组小鼠外周血清细胞因子发生明显改变，其中IL-4和IL-10的水平降低，而IL-1β和TNF-α显著增高（P＜0.01），说明aGVHD可下调抗炎细胞因子IL-4和IL-10水平，并上调炎细胞因子IL-1β和TNF-α水平，见表1。

3 aGVHD下调回肠occludin的表达

光镜下比较两组小鼠回肠组织中紧密连接蛋白occludin的表达情况如图3所示。在正常小鼠回肠黏膜组织上，occludin连续分布于小肠上皮细胞的边缘，主要位于细胞膜和细胞质，呈强阳性表达；aGVHD小鼠回肠黏膜组织坏死脱落，残存上皮细胞中occludin染色均变淡、稀疏，提示在aGVHD小鼠回肠组织中，occludin表达降低，肠黏膜屏障功能受损。

4 aGVHD对肠道菌群结构的影响

与正常对照组小鼠比较，aGVHD组肠道菌群物种组成发生明显改变，其中疣微菌门（Verrucomicrobia）及其下属的Verrucomicrobiae（纲）-Verrucomicrobiales（目）中的Verrucomicrobiaceae（科）、阿克曼菌（Ak-kermansia）和RF32显著上调；Adlercreutzia（纲）、红蝽杆菌目（Coriobacteriales）中的Coriobacteriaceae（科）、普雷沃菌科（Prevotellaceae）中的Prevotella（属）、理研菌科（Rikenellaceae）中的Rikenella（属）、Paraprevotellaceae（科）-Paraprevotella（属）、普雷沃菌属（Prevotella）、Christensenellaceae（科）、分节丝状菌（Candidatus arthromitus）、梭菌科（Clostridiaceae）、Dorea（属）、胃球菌属（Ruminococcus）、Mogibacteriaceae（科）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、水甲基杆菌属（Methylobacterium）、萨特菌属（Sutterella）、产碱杆菌科（Alcaligenaceae）、伯克氏菌目（Burkholderiales）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、Flexispira（属）、弯曲菌目（Campylobacterales）、气单胞菌目（Aeromonadales）中的Aeromonadaceae（科）和邻单胞菌属（Plesiomonas）明显减少。见图4。

表1 aGVHD引起血清细胞因子表达改变Table 1.The expression changes of cytokines in aGVHD（ng/L.Mean±SEM.n=5）

Figure 3.Occludin expression in ileal mucosa detected by immunohistochemistry（×400）.A：normal group；B：aGVHDgroup.图3 免疫组化检测回肠组织occludin的表达

5 aGVHD对靶器官组织的病理学改变

与正常对照组比较，aGVHD组小鼠肺泡腔内可见水肿液、红细胞及炎症细胞浸润，肺泡壁血管扩张充血，部分肺泡壁破坏；肝脏出现肝细胞体积增大、胞浆染色变淡，表现为水肿、肝索增粗紊乱、肝窦变窄等现象；脾脏皮质区域可见出血、坏死等改变；回肠黏膜上皮坏死脱落，见图5。

6 aGVHD对NLRP3炎症小体表达的影响

提取小鼠小肠总蛋白，行Western blot分析，进行NLRP3炎症小体活性检测，结果显示与正常对照组相比，aGVHD小鼠肠组织中NLRP3、ASC和caspase-1的表达情况均显著增加，见图6。

讨 论

aGVHD是异基因造血干细胞移植最常见并发症，经典理论为“细胞因子风暴学说”［4］，该学说把aGVHD的发生可以分为3个阶段：（1）预处理方案的毒性、感染和原发病造成组织损伤，引起细胞因子大量释放，如TNF-α、IL-1和IL-6，刺激组织相容性抗原和白细胞黏附分子在靶细胞（皮肤、肠黏膜和肝脏）上表达增加；（2）供者T细胞识别靶组织的组织相容性抗原，同时在活化信号IL-1的刺激下被激活，活化的供者T细胞增殖分化成为Thl亚群细胞，分泌Thl类细胞因子（如IL-2和IFN-γ）；（3）IL-2激活供者骨髓中新植活的单核细胞分泌更多的炎性细胞因子，如IL-1、TNF-α和NO，由此引起的炎症反应又导致更多的细胞因子释放从而加重局部器官的损伤。但其起始阶段的机制尚不明确，越来越多证据显示肠道菌群可能通过机体固有免疫应答反应影响该病发生发展［5］，NLRP3是一个新切入点，其本质由支架蛋白NLRs、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis speck-like protein，ASC）和caspase-1组成，是存在于树突状细胞、单核-巨噬细胞等胞浆中的一类模式识别受体，可通过识别肠道微生物，导致炎症小体激活，并发生自身寡聚化活化炎性caspase-1，进而将前炎症细胞因子加工为有活性的细胞因子（如IL-1β），再释放至细胞外参与多种炎症性和免疫性疾病的发生，最终导致aGVHD［6-7］；在小鼠肠道aGVHD模型中，小鼠外周血白细胞及肠道相关病变部位均检测到IL-1β和caspase-1表达明显增高，而NLRP3-/-或ASC-/-小鼠巨噬细胞对于细菌脂多糖刺激不能分泌IL-1β等细胞因子，如早期阻断树突状细胞和T淋巴细胞中IL-1β的表达或敲除IL-1受体，可明显提高肠道aGVHD的生存率［8-9］。此外有研究发现，在aGVHD等疾病诱发急性炎症后，肠壁水肿和屏障功能受损导致肠道菌群成分转移到宿主血液循环系统，甚至导致内毒素血症，从而进一步加重全身炎症反应［10］。

Figure 4.Effect of aGVHD on the structure of interstional flora.A：LEfSe analysis of intestinal flora structure in normal group and aGVHD group；B：LDA scoring chart of intestinal flora structure in normal group and aGVHD group图4 aGVHD对肠道菌群结构的影响

Figure 5.Pathological changes of lung，liver，spleen and ileum in aGVHDmice（HEstaining，×400）.图5 GVHD小鼠肺、肝、脾和回肠黏膜的病理改变

Figure 6.Expression of NLRP3 inflammasome in the intestine of aGVHDmice.图6 aGVHD小鼠小肠NLRP3炎症小体表达

在以上理论基础上，本实验建立小鼠aGVHD模型，发现aGVHD小鼠的NLRP3炎症小体活化、肠紧密连接蛋白occludin表达降低以及肠道菌群结构改变。由此推测aGVHD诱发小鼠血清中炎症因子浓度升高，是导致肠壁通透性增加的有效诱导因子，随之可能引发内毒素进入血液循环从而促发NLRP3炎症小体活化，进一步促进炎症因子释放，从而形成了恶性前馈循环。此外本实验也发现aGVHD可通过下调抗炎细胞因子IL-4和IL-10表达，提示可能存在其它信号通路抑制抗炎因子。以上结果为深入了解aGVHD的发生机理开辟新视角，并为临床防治该类疾病提供新机制。