ERK信号通路介导的EP300过表达在苯肾上腺素诱导小鼠心肌细胞肥大中的作用*

黄丽欣，彭波辉，彭 昌△，冯玉松，罗孝美，吴书琪，张焕婷

（遵义医科大学1附属医院儿内一科，2第一临床学院，3基础医学院生理教研室，贵州遵义563000）

病理性心肌肥厚是引起心脏衰竭和心源性猝死的重要原因。近年来病理性心肌肥厚发病率呈逐渐上升趋势，且防治措施尚不完善［1］，因此寻找新的治疗手段成为当前的研究热点。本课题组前期研究证实组蛋白乙酰化修饰失衡参与了苯肾上腺素（phenylephrine，PE）所致的病理性心肌肥厚，且进一步证实组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸（anacardic acid，AA）能够逆转PE所致的心肌肥厚［2］，但该过程的上游信号通路并不清楚。细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是MAPKs家族中的一个主要成员［3］。研究显示，ERK通路在细胞分化、增殖、应激反应和细胞凋亡中起着重要调节作用，且该通路可通过上调组蛋白H3乙酰化水平，参与酒精暴露所致的心脏发育相关基因过表达，提示该通路可能与组蛋白乙酰化修饰失衡介导的心肌肥厚相关［4］。因此，本研究应用PE诱导小鼠心肌细胞肥大模型，探讨ERK信号通路在组蛋白乙酰化酶抑制剂AA改善PE诱导的小鼠心肌细胞肥大中的作用，为心肌肥厚的防治提供参考资料。

材料和方法

1 实验动物

选取SPF级新生3 d的健康昆明小鼠120只，体重2.3～2.7 g，雌雄不限，由重庆医科大学动物中心提供，动物许可证号为SYXK（渝）2012-0015。

2 主要试剂与仪器

ERK抑制剂U0126、胶原酶Ⅱ和PE（Sigma）；胎牛血清（Gibco）；抗ERK及p-ERK单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；抗第9位赖氨酸乙酰化的组蛋白H3（acetylated histone H3 at lysine 9，H3K9ac）、β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）和E1A结 合 蛋 白p300（E1A-binding protein p300，EP300）单克隆抗体及兔IgG多克隆抗体（Abcam）；抗Alexa Fluor 488荧光标记的山羊抗小鼠IgG荧光Ⅱ抗（中杉金桥生物技术有限公司）；抗α-actin及HRP标记的Ⅱ抗（Proteintech）；Trizol总RNA提取试剂（BioTeke）；SDS-PAGE凝胶试剂盒（Beyotime）；免疫共沉试剂盒（Beaver）。

3 主要实验方法

3.1 心肌细胞原代培养选取出生3 d的昆明小鼠，在超净工作台上用无菌镊子及眼科剪取出心脏，轻柔挤出心脏中的血，预冷PBS液洗净残血，将其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎块，加入少许0.05%胶原酶Ⅱ反复吹打消化2 min，放置沉淀后，弃上清液，如此反复，直至消化完全。将收集的上清液离心（240×g、10 min），弃上清，沉淀与4 mL含20%胎牛血清的DMEM培养液重悬后接种到25 mL培养瓶中，在培养箱（37℃、5%CO2）中差速培养90min后，将细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入终浓度为0.1 mmol/L的BrdU后继续培养。

3.2 实验分组及细胞干预各组药物浓度参照文献［5-7］选取，采用PE干预心肌细胞48 h构建心肌细胞肥大模型后，按随机数字表法将心肌细胞分为正常（normal）组（不给予任何处理）、生理盐水（normal saline，NS）组（给予等量NS处理细胞）和PE组（用100 μmol/L PE干预心肌细胞48 h），探讨PE干预的小鼠心肌细胞中EP300和H3K9ac的表达水平及其相互调控关系。再将心肌细胞分为NS组、溶剂对照（DMSO+PE）组（用100μmol/L PE加等体积的DMSO处理心肌细胞）、PE组、AA+PE组（用50μmol/L AA处理后加入100μmol/L PE处理心肌细胞）、U0126+PE组（用10μmol/L U0126干预后加入100μmol/L PE处理心肌细胞）和AA+U0126+PE组（用50μmol/L AA孵育心肌细胞30 min后，再加入10μmol/L U0126处理，最终用100μmol/L PE干预心肌细胞48 h），进一步探讨ERK信号通路介导的EP300过表达在PE诱导小鼠心肌细胞肥大中的作用。

3.3 Western blot检测提取心肌细胞蛋白，用BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE分离蛋白，转膜，将PVDF膜浸泡于封闭液中，分别加入兔来源单克隆抗体H3K9ac、EP300、β-MHC、ERK和p-ERK，4℃摇床孵育过夜，TBST洗涤，每次5 min，洗涤6次，然后加入Ⅱ抗孵育，摇床上孵育1 h，TBST洗涤，每次5 min，洗涤6次，使用化学发光试剂发光显影。采用Bio-Rad图像分析仪进行图像扫描；应用Quantity One 4.4软件进行分析。

3.4 RT-qPCR检测引物用Primer Premier 5.0软件设计由宝生物公司合成。将β-MHC产物进行梯度稀释，运用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪扩增，做出标准曲线，得到R2值和扩增效率。β-MHC的上游引物序列为5′-CAAAGGCAAGGCAAAGAAAG-3′，下游引物序列为5′-GCAGAGGCACCAAAATGAAT-3′，产物大小为113 bp；β-actin的上游引物序列为5′-CCTTTATCGGTATGGAGTCTGCG-3′，下游引物序列5′-CCTGACATGACGTTGTTGGCA-3′，产 物 大 小 为289 bp。反应条件为：94℃30 s；94℃5 s，60℃30 s，40个循环。以β-actin作为内参照，所得数据用PCR仪自带的基于Pfaffl原理的相对定量数据分析软件处理。

3.5 免疫共沉淀移去培养液，PBS清洗，用结合缓冲液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，充分混匀后置于冰上孵育10 min，低温（4℃）20 000×g离心10 min，收集上清。将磁珠预处理后，分别加入EP300抗体和H3K9ac抗体，室温翻转20 min，弃上清，加入缓冲液洗涤2次后，加入抗原4℃翻转孵育过夜。将抗原吸附后的磁体/抗体/抗原复合物经磁性分离，再洗涤，弃掉上清，加入5×SDS-PAGELoading Buffer混合均匀，95℃加热5 min，室温下18 000×g离心10 min，收集上清液进行Western blot检测。

3.6 免疫荧光检测制作细胞爬片，吸出细胞培养液，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤，每次5 min，洗涤3次，0.3%Triton X-100室温孵育15 min，PBS洗涤，每次5 min，洗涤3次，室温下山羊血清封闭30 min，加入抗α-actin（1∶50）4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgGⅡ抗（1∶1 000），室温避光孵育1.5 h，PBS洗涤3次，每次5 min，再加入抗EP300Ⅰ抗4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，每次5 min，孵育Ⅱ抗，室温避光孵育1.5 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAPI染核5 min，PBS洗涤3次，每次5 min，抗荧光淬灭剂封片，于荧光倒置显微镜下观察，应用Image-Pro Plus专业图像分析软件分析。

4 统计学处理

所有数据用均数±标准差（mean±SD）表示，采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析，组间均数比较应用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PE干预的小鼠心肌细胞中EP300和H3K9ac的表达水平及其相互调控关系

Western blot结果显示，在培养的小鼠心肌细胞中，PE组EP300和H3K9ac表达水平显著高于NS组（P＜0.05），见图1A、B。免疫共沉淀结果显示，EP300可特异性与H3K9ac相互结合，见图1C。

2 各组小鼠心肌细胞中ERK和p-ERK的表达水平

Western blot结果显示，在培养的小鼠心肌细胞中，ERK表达水平在各组心肌细胞中无显著差异（P＞0.05），而p-ERK的表达水平在PE组显著高于生理盐水对照组（P＜0.05）；而ERK抑制剂和AA干预组的p-ERK水平均显著低于PE组（P＜0.05），见图2。

3 各组小鼠心肌细胞中H3K9ac水平

Western blot结果显示，在小鼠心肌细胞中，PE组H3K9ac水平显著高于NS组（P＜0.05）；而ERK抑制剂和AA干预组H3K9ac的水平均显著低于PE组（P＜0.05），见图3。

4 各组小鼠心肌细胞中组蛋白乙酰化酶EP300的表达水平

免疫荧光及Western blot结果表明，在培养的小鼠心肌细胞中，PE组EP300表达水平显著高于NS组（P＜0.05）；AA及ERK抑制剂干预组EP300的表达水平显著低于PE组（P＜0.05），见图4。

5 ERK信号通路在AA逆转PE诱导心肌肥大标志物β-MHC过表达中的作用

RT-qPCR及Western blot结果显示，PE组心肌肥大标志物β-MHC的mRNA水平及蛋白水平均显著高于NS组（P＜0.05），ERK抑制剂及AA干预组β-MHC的mRNA及蛋白水平均显著低于PE组（P＜0.05），见图5。

讨 论

心肌肥厚是心肌细胞对各种刺激因素所产生的适应性反应，分为生理性肥厚和病理性肥厚，病理性心肌肥厚主要表现为心肌细胞体积增大和心肌间质增生，是导致慢性心力衰竭和心源性猝死的独立危险因素［8］。本课题组前期研究证实组蛋白乙酰化修饰失衡参与了PE诱导的小鼠心肌肥厚［9］，而AA能够抑制组蛋白乙酰化酶（histone acetylases，HATs）介导的组蛋白H3K9高乙酰化进而改善心肌肥厚［10］，且进一步证实P38丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogenactivated protein kinase，P38 MAPK）信号通路参与了AA改善PE诱导的心肌肥厚［11］，但MAPK信号通路家族还包括c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和ERK信号通路，而ERK和JNK信号通路是否参与AA改善PE诱导小鼠心肌肥厚并不清楚。因此，本研究应用PE诱导小鼠心肌细胞肥大，来探讨ERK信号通路在EP300介导的组蛋白H3K9ac乙酰化失衡致心肌细胞肥大中的作用。

Figure 1.The expression of EP300 and H3K9ac in the mouse myocardial cells and their mutual regulation.A：the protein levels of EP300；B：the protein levels of H3K9ac；C：co-immunoprecipitation（Co-IP）in cell lysates of mouse myocardial cells exposed to three different experimental conditionswith anti-EP300-protein Gmagnetic beads and immunoblot（IB）with an anti-H3K9ac or anti-EP300 antibody for evaluation of protein expression.Input：positive control；IgG：negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NSgroup.图1 小鼠心肌细胞中EP300和H3K 9ac的表达水平及其相互调控关系

Figure 2.The protein levels of ERK and p-ERK in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.图2 各组小鼠心肌细胞中ERK及p-ERK的蛋白水平

Figure 3.The level of H3K9ac in the mouse myocardial cells with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.图3 小鼠心肌细胞中组蛋白H3K9ac水平的比较

Figure 4.The expression of EP300 in the mouse myocardial cells with different treatments.A：the immunofluorescence images of myocardial cells（scale bar=20μm）；B：the EP300 average optical density；C：the protein levels of EP300 were assayed by Western blot.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs NSgroup；#P＜0.05 vs PEgroup.图4 小鼠心肌细胞中组蛋白乙酰化酶EP300的表达水平

组蛋白乙酰化与基因的活化有着密切关系，而去乙酰化与基因沉默有关，组蛋白乙酰化/去乙酰化失衡在心肌肥厚中发挥着重要作用。组蛋白乙酰化通过HATs介导，HATs在心脏表达的亚型主要包括：EP300、p300/CBP辅助因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）、组蛋白乙酰化酶氨合成通用控制蛋白5（general control nonderepressible-5，GCN5）、CREB结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）和类固醇受体辅活化子1（steroid receptor coactivator-1，SRC1）［12-13］。EP300能改变染色质结合转录因子，松解染色质结构而影响基因表达。EP300/CBP作为一种转录辅助激活因子，能与多种转录因子互相作用，是介导心肌肥厚的关键因子［14］。EP300和CBP共同调控心脏肥厚相关基因过表达，可能在PE诱导的心肌肥大中发挥重要作用。本研究结果显示，在PE诱导的小鼠心肌肥大细胞中，EP300及组蛋白H3K9ac水平显著高于生理盐水对照组，为了进一步证实两者的关系，我们进一步应用免疫共沉淀验证，结果表明组蛋白H3K9ac受EP300直接调控。以上结果提示EP300过表达介导的组蛋白H3K9乙酰化修饰失衡可能参与了心肌肥厚发生、发展的病理过程。但是组蛋白乙酰化酶EP300介导的其他组蛋白（如：H3K27ac）修饰是否参与了病理性心肌肥厚过程，需进一步证实。

研究显示在病理性心肌肥厚大鼠心肌细胞中，ERK磷酸化水平较高，降低其水平可改善心肌肥厚［15］。研究证实ERK在心肌细胞中的下游靶点包括EP300和CBP等［16-17］，表明ERK能够调控EP300的表达。当ERK受到体内、体外刺激时，经过一系列反应发生磷酸化而激活，进一步诱导肥大相关基因表达。本研究结果证实PE组p-ERK水平显著升高，与EP300变化水平相一致，但ERK水平并没有明显变化，表明ERK并没有参与PE诱导心肌肥厚的过程，而ERK可能在上述病理过程中发挥了重要作用，同时也提示在PE诱导的心肌肥厚小鼠心肌组织中ERK信号通路处于激活状态，参与心肌肥厚的信号通路较多，其他信号通路是否在PE诱导的小鼠心肌肥厚组织中也处于激活状态（如JNK）尚待进一步研究。研究证实PE所致的心肌细胞肥大中MEF-2和β-MHC会显著升高［18］，β-MHC是常用的心肌肥厚标志物，在心脏收缩功能中起着重要的作用，因此我们进一步检测了β-MHC的转录水平及蛋白水平。结果显示，PE组小鼠心肌细胞肥大标志物β-MHC mRNA水平及蛋白水平均显著升高，表明β-MHC是判断PE诱导心肌细胞肥大的重要标志物之一。为进一步证实ERK信号通路对EP300介导的组蛋白H3K9ac乙酰化失衡在PE诱导小鼠心肌细胞肥大中的作用。本实验应用ERK抑制剂U0126及组蛋白乙酰化酶抑制剂AA干预PE处理的小鼠心肌细胞，结果表明分别经过上述两种抑制剂干预后的小鼠心肌细胞中p-ERK、H3K9ac、β-MHC及EP300表达水平与单纯PE处理组相比均显著降低，进一步提示我们ERK信号通路参与的EP300介导的组蛋白乙酰化失衡参与了PE诱导的小鼠心肌细胞肥大。

综上所述，ERK信号通路在EP300介导的组蛋白H3K9ac乙酰化失衡致PE诱导小鼠心肌细胞肥大中扮演着重要的角色，提示ERK信号通路可能成为心肌肥厚防治的新靶点。