Klotho、TXNIP在老年糖尿病心肌病中的表达及其临床意义

伊芬秀

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是DM病人后期的慢性并发症之一，其以心脏舒张功能异常为特征，后期收缩功能逐渐下降[1]。但DCM早期通常心脏无明显器质性与功能性病变，导致其缺乏明确的病理特异诊断方法，使得DCM早期防治较为困难[2]。因此，临床中急需寻找与DCM相关的评估指标。Klotho作为一种抗衰老基因，在慢性炎症和抗氧化应激中有重要作用[3]。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)是一种内源性硫氧还蛋白结合抑制蛋白，研究表明，其在DM病人体内呈异常高表达[4]。Klotho、TXNIP均与DM有密切联系，但目前关于二者在DCM病人中的研究较少，因此，本研究通过检测DCM病人Klotho mRNA、TXNIP表达水平，探讨其与DM病人并发心肌病的相关性，以期为控制DM病情进展、降低心肌病发生率提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年5月至2020年3月期间于本院就诊的67例老年DCM病人为研究对象(DCM组)，年龄62～86岁，平均(74.33±11.40)岁，男32例，女35例；选取同期住院及门诊治疗的老年DM无心肌病病人72例作为DM组，年龄61～85岁，平均(73.47±11.06)岁，男37例，女35例；选取同期老年健康体检者84例作为对照组，年龄61～84岁，平均(72.71±10.86)岁，男42例，女42例。3组间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.05)。

纳入标准：(1)符合美国糖尿病学会(American diabetes association，ADA)和WHO最新的DM诊断标准[5]，同时根据临床诊断确诊DCM病人，其中诊断要点：临床有劳累性心悸、呼吸困难、胸闷；心电图大致正常，心电图证实左心室顺应性下降，舒张功能减退，A峰上升、E峰下降，E/A比值<1.0；(2)病历资料齐全且自愿参加本研究者；(3)冠脉造影显示无冠状动脉病变或无心肌内广泛微血管病变者。排除标准：(1)肝肾功能异常、甲状腺功能亢进者；(2)高血压、原发性心肌病、先天性心脏病者；(3)合并肿瘤等恶性疾病者。本研究经本院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学标准。

1.2 主要试剂与仪器 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(上海恒斐生物科技有限公司)；miScript SYBR®Green qPCR试剂盒(德国凯杰公司)；TXNIP ELISA试剂盒、BNP ELISA试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；cTnI ELISA试剂盒(武汉维克赛思科技有限公司)；TIMP-1 ELISA试剂盒、MMP-2 ELISA试剂盒、ANP ELISA试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司)。酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司)；qRT-PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 样品采集及保存：采集受试对象入院时晨起空腹静脉血样，3000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80℃保存待测。

1.3.2 一般资料收集：收集整理病人一般资料，主要包括性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、高血压，采用全自动生化分析仪检测餐后2 h血糖(2hPG)、HbA1c、TG、TC、LDL-C、HDL-C水平。

1.3.3 TXNIP及血清学指标水平检测：采用ELISA法检测受试者血清TXNIP、BNP、肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ，cTnI)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metralloproteinase-1，TIMP-1)、心钠素(atrial natriuretic peptide，ANP)、基质金属蛋白酶-2(matrix metralloproteinase-2，MMP-2)水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 血清Klotho mRNA水平测定：采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清中Klotho mRNA表达水平。Klotho正向引物为5′-ACCTGGTGGCGCACAC-3′，反向引物为：5′-TTGGCAAACCAACCTAGTACA-3′；内参GAPDH正向引物为：5′-GACCTGGTGGCGCACAC-3′，反向引物为：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。qRT-PCR反应体系共20μL：cDNA(50 ng/μL)2μL，miScript SYBR® Green Mix 10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.8μL，双蒸水6.4μL，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，连续进行40个循环。每份样品均设3个重复孔，采用2-△△CTDelta法计算血清Klotho mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 3组一般资料比较 3组饮酒、吸烟、高血压病人比例比较，差异均无统计学意义(P<0.05)。DCM组2hPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平高于DM组和对照组，HDL-C水平低于DM组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。DM组2hPG、HbA1c、TC、TG、LDL-C水平高于对照组，HDL-C水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 3组血清Klotho mRNA、TXNIP水平比较 DCM组血清TXNIP水平高于DM组和对照组，Klotho mRNA水平低于DM组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。DM组血清TXNIP水平高于对照组，Klotho mRNA水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组血清Klotho mRNA、TXNIP水平比较

2.3 3组血清学指标水平比较 DCM组BNP、cTnI、TIMP-1、ANP水平高于DM组和对照组，MMP-2水平低于DM组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。DM组BNP、cTnI、TIMP-1、ANP水平高于对照组，MMP-2水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4 DCM病人血清Klotho mRNA、TXNIP与血清学指标的相关性 Pearson相关分析结果显示，DCM病人血清Klotho mRNA与TXNIP呈负相关(r=-0.646，P<0.05)，且Klotho mRNA与MMP-2呈正相关(P<0.05)，与BNP、cTnI、TIMP-1、ANP呈负相关(P<0.05)；TXNIP与MMP-2呈负相关(P<0.05)，与BNP、cTnI、TIMP-1、ANP呈正相关(P<0.05)。见表4。

2.5 影响DM病人发生心肌病的Logistic回归分析 将DM病人是否发生心肌病作为因变量，校正年龄、性别、饮酒、吸烟、高血压、2hPG、HbA1c、TC、TG、HDL-C、LDL-C等因素后，以Klotho mRNA、TXNIP、BNP、cTnI、TIMP-1、ANP、MMP-2水平为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示TXNIP、ANP是影响DM病人发生心肌病的独立危险因素(P<0.05)，Klotho mRNA是影响DM病人发生心肌病的保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响DM病人发生心肌病的多因素Logistic回归分析

3 讨论

DM是一类以胰岛素抵抗或慢性胰岛素缺乏为特征的代谢性疾病，DM的并发症是导致病人致残的主要原因，也是严重危害DM病人生命健康的主要因素[6]。DCM是DM后期出现的一种心室舒张功能异常的慢性并发症[7]。目前DCM可通过病理活检、超声心动图、心脏磁共振等方法确诊，但其缺乏更为简单、有效的血清学生化指标作为早期诊断参考依据。

Klotho家族包括α-Klotho和β-Klotho 2种，可调控衰老过程及与衰老相关的疾病，参与组织、肝、肾等器官的代谢过程，与糖尿病肾病有重要联系。Klotho可与细胞表面的受体结合，抑制特异性转录因子叉头框蛋白O1的磷酸化，从而发挥对过氧化物的清除作用[8]。研究表明，Klotho可通过影响一氧化氮(NO)的生成量，发挥对血管疾病的调节作用[9]。本研究结果显示，DCM病人血清Klotho mRNA水平低于DM病人和健康人群，DM病人血清Klotho mRNA水平低于健康人群，与刘洪等[10]研究结果中Klotho表达趋势一致。多因素分析显示Klotho mRNA是影响DM病人发生心肌病的保护因素。提示Klotho的低表达可能与DCM的发生、发展密切相关，且可能是由于DCM病人处于病理状态下，其内皮细胞发生一定的损伤，体内NO生成量下降，影响循环血及血管壁中的一些活性因子表达，进而影响Klotho的表达量。

TXNIP可影响胰岛B细胞分泌胰岛素的能力，调节肝脏和脂肪组织对胰岛素的抵抗[11]。此外，TXNIP在微血管病变中发挥重要作用，且是通过影响血管炎症对血管内皮发挥作用[12]。本研究结果显示，DCM病人血清TXNIP水平高于DM病人和健康人群，DM病人血清TXNIP水平高于健康人群，与刘敏洁等[13]研究结果相似；且TXNIP是影响DM病人发生心肌病的独立危险因素。推测可能病人在病理状态下血管中氧化应激、高糖、紊乱血流以及其他因素带来的血管炎症增加，同时血管内皮损伤增加，进而影响TXNIP的表达量。此外，本研究结果中，DCM病人血清Klotho mRNA与TXNIP水平呈负相关，且二者与血清学指标MMP-2、BNP、cTnI、TIMP-1、ANP均呈一定的相关性，而ANP、cTnI等血清学指标均是心肌病相关指标[14-15]。进一步提示，Klotho、TXNIP在DM病人体内可能发挥协同作用，与DCM的发生、发展有密切联系，临床中除了要密切监测Klotho、TXNIP水平变化外，还可对ANP等心肌病相关血清学指标进行检测，以便临床中及时采取针对性治疗措施，降低心肌病的发病率。

综上所述，Klotho、TXNIP的低、高表达可能与DCM的发生、发展有密切联系，临床中可考虑将二者作为DCM的血清学指标进行深入研究。控制TXNIP、ANP、Klotho mRNA水平稳定，可能有利于改善DM并发心肌病病人的预后。但Klotho、TXNIP共同影响DCM的具体分子机制目前尚不明确，有待进一步研究和探索。