肺癌组织中VEGF、EGFR表达与ADC直方图相关参数的关系

李臻 耿广 侯桂英 吴新娟 郭海荣 康若琛 李雯 纪俊雨 袁帅 张莹 孙梅花

肺癌是我国发病率与死亡率最高的恶性肿瘤[1]，血管生成在肿瘤的发生、发展和转移的过程中起着重要的作用，而血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子受体(EGFR)是两种与肿瘤血管生成密切相关的重要蛋白分子，有研究表明，VEGF与EGFR在肿瘤血管生成中起协同作用，且VEGF与非小细胞肺癌患者的临床分期、淋巴结转移密切相关[2,3]。近年来磁共振弥散加权成像(DWI)直方图分析的方法被应用于各种肿瘤的检查中[4,5]，将肿瘤所有体素的ADC值进行统一分析，得出相关特征参数，可更好的反映肿瘤的异质性，且属于无创操作，避免了肺穿活检对患者造成的损伤。本研究拟分析肺癌ADC直方图相关参数与肺癌组织中VEGF、EGFR表达量及淋巴结转移的关系，判断能否以ADC直方图预测肺癌组织中相关蛋白的表达及淋巴结转移。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年4月至2019年4月于我院行手术切除治疗的肺癌患者，共纳入32例患者，其中男20例，女12例;年龄39～72岁，平均年龄57.5岁;病理类型包括腺癌15例，鳞癌8例，小细胞癌5例，其他4例;淋巴结转移15例，淋巴结未转移17例。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：(1)病变包含直径>3 cm的孤立性实性区域(团块或实变)；(2)术前未接受放疗、化疗或其他抗癌治疗；(3)术前接受肺部MRI检查；(4)患者术中同时行纵隔淋巴结清扫以确定有无转移。排除标准：(1)肺部MRI检查图像有较多运动或磁敏感伪影，影响数据测量者；(2)病变实性成分较小，亚实性或磨玻璃密度成分占比较大。

1.3 MR扫描序列与参数 采用我院1.5T 磁共振扫描仪(Magnetom avanto,Siemens healthcare,Germany)进行肺部MRI检查，使用体部8通道表面线圈。在一次检查中完成T1WI、T2WI与DWI扫描。T1WI与T2WI采取吸气末屏气扫描，T1WI扫描参数：TR 189 ms，TE9 ms，FOV33 cm，矩阵256×256，层厚4 mm，层间隔1.5 mm；T2WI扫描参数：TR2 200 ms，TE 90 ms，FOV 33 cm，矩阵320×320，层厚4 mm，层间隔1.5 mm。DWI采用单次激发自旋回波-平面回波成像序列(spin echo-echo planar imaging,SE-EPI),在自由呼吸状态下由导航回波法的呼吸触发采集图像。b值分别取0、400和800 s/mm2，TR4 000 ms，TE48.9 ms，FOV33 cm，矩阵128×128，层厚4 mm，层间隔1.5 mm。

1.4 DWI图像分析与测量 将所有患者的DWI图像以DICOM格式从西门子工作站导出至个人电脑，用FireVoxel软件(纽约大学，NY，USA)进行图像分析。参考T1WI与T2WI图像，在所有包含病变的层面手工勾画ROI，范围尽可能包含全部病变，包括坏死、囊变、出血区。以单指数模型计算ADC值，并绘制全病变ADC值直方图。记录其特征参数，包括峰度、偏度、熵、ADC平均数、ADC中位数、ADC标准差、病变体积和ADC第5、10、15、30、50、70、90百分位数(ADC5th、ADC10th、ADC15th、ADC30th、ADC50th、ADC70th、ADC90th)。其中ADC第n百分位数表示在该点n%组成直方图的像素值位于其左侧。

1.5 免疫组化染色与结果判定

1.5.1 免疫组化染色：所有组织块经甲醛溶液固定与石蜡包埋，将每个组织块进行厚度4 μm连续切片，其中1片行常规HE染色，其余切片平均分为2份，分别进行VEGF和EGFR免疫组化染色。采用免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法，实验步骤按照试剂盒说明书进行。阳性对照由试剂公司提供，阴性对照由PBS液代替一抗得到。其中鼠抗人VEGF、EGFR单克隆抗体及通用型SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.5.2 判定方法：VEGF和EGFR的阳性部分位于细胞浆或细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒。VEGF和EGFR表达以细胞染色强度和细胞阳性百分率得分之和进行判定。随机选择5个高倍镜视野(400倍)进行判断：①无染色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，黄褐色记3分；② 5%<阳性率≤25%记1分，25%<阳性率≤50%记2分，阳性率>50%记3分。上述2项相加，0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(1+)，3～4分为中等阳性(2+)，5～6分为强阳性(3+)。

1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0统计软件，VEGF、EGFR表达和各ADC直方图相关参数之间的相关性采用Spearman秩和相关分析，VEGF、EGFR表达和肺癌病理分型间的相关性采用Kruskal-Wallis单因素方差分析，VEGF、EGFR表达和肺癌淋巴结转移间的相关性采用Mann-Whitney U检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴结转移与ADC直方图相关参数的关系 患者是否有淋巴结转移与峰度呈显著负相关(P=0.03)，与其余ADC直方图相关参数无显著相关(P>0.05)。见表1。

2.2 VEGF、EGFR表达与ADC直方图相关参数的关系 VEGF表达与各ADC直方图相关参数均无显著相关(P>0.05)；而EGFR表达与ADC平均数、中位数、标准差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均呈显著负相关(P均<0.05)。见图1，表1。

图1 EGFR表达量与ADC平均数、标准差、ADC70th和ADC90th的关系

表1 ADC直方图相关参数与VEGF、EGFR及淋巴结转移的相关性

2.3 VEGF、EGFR表达与肺癌病理分型及淋巴结转移的关系 VEGF、EGFR表达与肺癌病理分型间无显著相关(P>0.05)，而VEGF、EGFR表达与淋巴结转移显著相关(P值分别为0.001和0.004)。见表2。

表2 VEGF、EGFR与不同病理类型和淋巴结转移的关系

3 讨论

磁共振检查中的DWI序列，可于活体显示肿瘤内水分子弥散情况，并以ADC值的大小评价水分子弥散程度。DWI被广泛应用于各种肿瘤的研究中，在肺癌方面，ADC值在肺内肿块良恶性的鉴别[4]、病理分型[5]及预后预测方面[6]均可发挥重要作用。常规测量ADC值是在肿瘤最大横截面选取ROI(感兴趣区)，取该区域的平均ADC值，同时避开空洞、出血、坏死区域，但该方法未将肿瘤整体纳入测量范围，容易产生测量偏倚。本研究将直方图的方法引入肺癌ADC图的测量，通过绘制肺癌ADC直方图将全部病变体素纳入测量范围，并得到一系列直方图相关参数(包括峰度、偏度、熵、ADC平均数、ADC中位数、ADC标准差、病变体积和ADC第5、10、15、30、50、70、90百分位数)，可更好的反应肿瘤的异质性。

VEGF是一种肝素结合同源二聚体糖蛋白，它属于一个生长因子家族(还包括VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盘生长因子PIGF)。VEGF是肿瘤血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，在缺氧状态下，激活的癌基因和一系列细胞因子导致VEGF表达量升高，VEGF通过旁分泌方式特异性的作用于血管内皮细胞，促进肿瘤血管内皮细胞增殖和血管形成，同时使肿瘤血管通透性增高，促进血浆内纤维蛋白原外渗，为血管形成过程中的细胞迁移提供纤维网络。VEGF是肿瘤血管生成的主要调节因子，且可作为肺癌靶向治疗的潜在靶点[7-9]。EGFR是一种重要的酪氨酸激酶受体，在多种上皮性肿瘤细胞中呈高表达，EGFR与多种肿瘤细胞活动有关，如增殖、血管生成、转移、凋亡抑制、化疗及辐射抗性等，它能导致其下游信号传递过程异常激活，使细胞的转化、增殖加快，抵抗细胞凋亡，细胞生存期延长，与肿瘤的发生、发展、预后以及治疗反应等相关[10]。近年来以为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)靶点的分子靶向治疗研究较多，以“吉非替尼、厄洛替尼”为代表，临床试验显示，EGFR-TKIs在EGFR突变人群有效率可达58%～83%，中位生存期提高至18 ～30个月[11-13]。

VEGF和EGFR在肺癌组织中呈高表达，且两者具有相关性，这已被多项研究证实。如张冉等[3]得出VEGF和EGFR在原发性肺癌组织的表达率(68.25%和47.62%)均显著高于肺良性病变组织(20.00%和13.33%)，且VEGF与EGFR的阳性表达呈正相关，两者在原发性肺癌的发生发展中可能起协同作用。宋懿懿等[2]检测了186例非小细胞癌(NSCLC)患者在不同临床病理特征下VEGF和EGFR的表达，发现VEGF与NSCLC淋巴结转移有相关性，EGFR在非吸烟、女性和腺癌组织中高表达，与淋巴结转移及分期密切相关；且NSCLC组织中VEGF和EGFR的表达具有相关性。袁卫红等[14]认为EGFR在NSCLC组织与癌旁组织(距肿瘤边缘<3 cm)的表达率(88%、64%)均高于肺部良性病变(10%)，而距肿瘤边缘>6 cm的正常肺组织表达率与肺部良性病变无显著差异；且EGFR表达阳性的NSCLC患者术后6、12、18、24个月复发率均明显高于EGFR表达阴性的患者，提示EGFR与NSCLC患者预后关系密切。

本研究发现，肺癌组织VEGF的表达与ADC直方图各相关参数、肺癌病理分型(腺癌、鳞癌、小细胞癌及其他)均无显著相关性(P>0.05)，而与患者是否有淋巴结转移显著相关(P=0.001)。探讨肿瘤ADC直方图相关参数与肿瘤相关因子关系的文献较少。Meyer等[15,16]比较了宫颈癌和直肠癌的ADC直方图相关参数与相应肿瘤的VEFG表达，两种肿瘤均无显著相关性(P>0.05)，与本研究结论类似，分析原因可能为：只有当b值小于200 s/mm2时，DWI才对组织灌注敏感，本研究b值分别取0、400和800 s/mm2，未包括小于200 s/mm2的b值，因此得到的ADC相关参数未反映组织灌注信息。

本研究中EGFR表达与ADC平均数、中位数、标准差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均呈显著负相关(P均<0.05)。Meyer等[15]在一项对宫颈癌的研究中，得出EGFR的表达与ADC平均数、中位数、众数、ADC10th、ADC25th、ADC75th、ADC90th均呈显著负相关(P均<0.05)；在其对直肠癌[16]的研究中，得出EGFR仅与ADC最大值显著相关(P=0.02)，而与其他ADC直方图相关参数均无相关性。虽然肿瘤类型、部位不同，但两项研究都倾向于认为ADC高值百分数与EGFR有显著相关。本研究团队之前有一项研究以ADC直方图鉴别肺部病变良恶性，发现肺癌的偏度、峰度、平均数、标准差、ADC50th、ADC70th、ADC90th均低于肺部良性病变[17]。所以与其他参数相比，ADC高值百分数可能与EGFR及病变恶性程度有更好相关性，即ADC高值百分数越高，EGFR表达越少，且病变恶性程度越低。为何ADC高值百分数较其低值百分数能更好的反映组织EGFR的表达及恶性程度，一个可能的解释是:肺癌较肺部良性病变含有更多的黏液、微出血 与组织紊乱成分，这些成分均导致水分子弥散受限,进而ADC值减小,而ADC高值百分数可更好地反映这些成分的影响。

本研究中ADC直方图的峰度与患者是否有淋巴结转移呈负相关(P=0.03)。峰度反映的是直方图形态的陡峭程度，峰度越大，直方图的形态越陡峭。以正态分布图像为标准，正态分布的峰度系数为3，峰度<3的直方图则相对于正态分布平缓，而峰度>3的直方图则相对于正态分布陡峭。峰度越高，肿瘤的内部结构越致密。本结果说明，伴有淋巴结转移的肺癌ADC直方图较未发生淋巴结转移者更加平缓，即肺癌内部结构越致密越不易发生淋巴结转移。

VEGF与EGFR的表达与肺癌的病理类型无关，但与患者是否有淋巴结转移显著相关，这已在多项研究[18,19]得到证实。

肺癌组织中EGFR表达与多个ADC直方图相关参数尤其是ADC高值百分数呈负相关，而VEGF表达却与其无相关性。淋巴结转移与ADC直方图的峰度呈显著相关。DWI检查中的ADC直方图相关参数可以用于肺癌组织中EGFR水平及是否有淋巴结转移的预测，具有一定临床应用价值。