7,8-DHF对大鼠心肌缺血-再灌注损伤影响及机制

李浩然,迟晓琦,吴雪,张文秀,韩晓华

(青岛大学基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

心肌缺血通常由冠状动脉的狭窄或阻塞所引发。心肌组织中血流的减少或者阻断会引起冠状动脉所支配区域的营养物质供给和氧气供应减少，最终使心肌细胞发生凋亡或坏死[1-2]。但是缺血部位心肌组织的血供恢复后，由于细胞内活性氧增多、钙离子失衡、细胞能量代谢异常、炎症反应等原因[3]，会使得心肌细胞遭受更为严重的损伤[4]，即缺血-再灌注(I/R)损伤。I/R损伤通常会引发心肌顿抑、室内压下降等心肌功能的抑制，其预防与治疗长期以来都是心血管研究领域的重要课题。7,8-二羟基黄酮(7,8-DHF)是黄酮化合物之一。最近有研究表明，7,8-DHF是酪氨酸激酶B(TrkB)受体的特异性激动剂[5]，具有强大的神经营养和保护作用[6]。在心血管疾病的相关研究中发现，苯肾上腺素诱导的大鼠胸主动脉收缩可被7,8-DHF显著抑制, 而且该作用与降低细胞内钙水平和激活一氧化氮/环鸟苷酸信号通路有关[7]。此外，7,8-DHF还能拮抗过氧化氢(H2O2)诱导的细胞凋亡[8]。但是7,8-DHF对I/R损伤是否具有保护作用尚未见报道。本研究通过对大鼠左冠状动脉前降支(LAD)进行结扎处理，建立心肌I/R损伤的动物模型，探讨恢复血供前7,8-DHF预处理对再灌注心肌是否具有保护作用，并初步探讨可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药品和仪器

7,8-DHF(D1916)购自东京化成工业株式会社。抗Bcl-2抗体(AB112)、抗Bax抗体(AF0057)和BCA蛋白检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司，抗cleaved caspase-3(CST-9661)抗体购自美国CST公司，抗β-actin抗体购于北京博奥森生物技术公司，实验所用其他试剂均为国产分析纯。所用实验仪器包括小动物呼吸机(型号ALC-V8，上海奥尔科特生物科技有限公司)、Eppendorf高速离心机、SpectraMax M5多功能酶标仪、微量分析天平和Western 显影仪等。

1.2 动物分组及处理

实验选用8～10周龄的雄性Wistar大鼠18只，体质量(250±10)g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司(许可证号：SCXK(鲁)20190003)。实验开始前，大鼠先在23～25 ℃、12 h/12 h明暗周期环境下饲养7 d，自由饮水和进食。造模前，大鼠先禁食12 h，期间自由饮水。将大鼠随机分为3组，每组6只。①假手术组(Sham组，A组)：大鼠麻醉并且固定后，通过口腔接入呼吸机辅助其呼吸；打开胸腔，将缝合线穿过LAD下方但不结扎，20 min后腹腔注射含体积分数0.05二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲液(PBS)，10 min后缝合伤口。②I/R组(B组)：开胸，结扎LAD 20 min后腹腔注射含体积分数0.05 DMSO的PBS，10 min后取出结扎线，即缺血30 min后恢复血供。③I/R+7,8-DHF组(C组)：在结扎LAD 20 min后腹腔注射7,8-DHF(10 mg/kg)，其他处理与I/R组相同。所有大鼠均在恢复血供3 h后处死。本实验过程遵循国际实验动物使用标准和伦理学要求。

1.3 血清及心肌标本制备

大鼠心脏恢复血供3 h后，通过尾静脉取血约1.0 mL，先存放于4 ℃冰箱中静置1 h，随后再以3 000 r/min离心15 min，分离血清于新EP管中，冻存于-80 ℃冰箱备用。将心脏快速取出，放入预冷的PBS中清洗，保留结扎线以下的部分，剪去右心室，其余部分(左心室为主)用液氮速冻，-80 ℃保存备用。

1.4 血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活力检测

血清标本送至海军青岛第一疗养院检验科测定。血清中LDH的活力采用速率法测定，CK-MB的活力采用免疫抑制法测定。

1.5 心肌细胞凋亡有关蛋白的Western blot检测

取20～30 mg心肌组织，将其充分剪碎后放入预冷的玻璃匀浆器中，加入200～300 μL蛋白裂解液充分研磨，以12 000 r/min离心20 min，留取上清液，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。每个样本的蛋白上样量均为20 μg，蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，用100 g/L脱脂奶粉室温慢摇封闭90 min，分别加入抗Bcl-2抗体(1∶1 000)、抗Bax抗体(1∶1 000)、抗cleaved caspase-3抗体(1∶1 000)和抗β-actin抗体(1∶10 000)。在4 ℃冰箱内的摇床上慢速摇动孵育过夜，随后以TBST洗膜3次，每次10 min，再加入二抗，室温孵育1 h后，以TBST洗膜3次，最后用ECL发光液显影。用软件Image J对条带的灰度值进行分析。结果以目的蛋白灰度值与相对应的β-actin灰度值的比值表示。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 7,8-DHF对血清LDH和CK-MB活力的影响

与Sham组相比，I/R组大鼠血清中LDH的活力升高了35%(F=18.770，q=7.167，P<0.01)；与I/R组相比，I/R+7,8-DHF组LDH活力下降了28%(q=7.800，P<0.01)。血清CK-MB活力的变化与LDH类似，与Sham组相比较，I/R组大鼠血清中CK-MB的含量升高了71%(F=5.422，q=4.240，P<0.05)。与I/R组大鼠相比，I/R+7,8-DHF组CK-MB活力下降了37%(q=3.788，P<0.05)。提示7,8-DHF抑制了I/R诱导的心肌细胞损伤。见表1。

表1 各组大鼠血清LDH和CK-MB活力的比较

2.2 7,8-DHF对心肌细胞凋亡有关蛋白表达影响

与Sham组相比，I/R组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白的表达显著降低(F=6.217，q=4.698，P<0.05)，Bax和cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(F=14.720、7.653，q=7.546、4.975，P<0.01)，表明I/R损伤会导致心肌细胞发生凋亡。与I/R组相比，I/R+7,8-DHF组Bcl-2蛋白表达升高了86%(q=3.797，P<0.05)，Bax蛋白表达减少了45%(q=4.977，P<0.01)，cleaved caspase-3蛋白表达减少了42%(q=4.584，P<0.05)，说明7,8-DHF有效抑制了I/R损伤造成的心肌细胞凋亡。见表2和图1。

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡有关蛋白表达的比较

A：sham组；B：I/R组；C：I/R+7,8-DHF组。

3 讨 论

急性心肌梗死(AMI)通常由冠状动脉内血流急剧减少或中断造成，会导致心肌组织中血液供应的减少，从而引发严重后果。近年来AMI的防治已取得较大进展[9]，但是缺血后的心肌组织在血流恢复之后，依然会出现生理功能的进一步损伤，称为心肌I/R损伤。I/R损伤会导致心肌顿抑、心律失常和心肌坏死等恶性后果，其预防与治疗一直是AMI治疗中的重要环节，但是目前还无特别有效的防治方法。

心肌I/R损伤存在明显的心肌细胞凋亡，这可能与氧化应激损伤、细胞内钙超载、炎症反应等密切相关[10-11]。细胞凋亡受到多种信号通路和蛋白的调控。Bcl-2和Bax均属于Bcl-2家族蛋白成员，Bax蛋白形成二聚体后可增加线粒体膜通透性，促进线粒体内细胞色素C释放，诱导细胞凋亡，而Bcl-2蛋白则通过抑制Bax二聚体形成抑制细胞凋亡。细胞凋亡中最重要的效应酶是caspase-3，它激活后可以裂解形成分子量为17 000～19 000的片段，称为cleaved caspase-3。所以通过检测Bcl-2、Bax以及cleaved caspase-3蛋白水平，可以评估心肌细胞凋亡的发生[12]。

7,8-DHF是黄酮家族中的一员，具有神经保护[13]、抗氧化[14]、抗炎症[15]、抗肿瘤[16]、抗增殖[17]等多种生物学作用。黄酮类化合物的心血管保护作用已有较多研究[18]。例如，黄芩苷可通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号途径以及抑制核转录因子-κB(NF-κB)信号传导来抑制心肌细胞凋亡和炎症[19]，从而抑制心肌I/R损伤。但是，7,8-DHF对I/R造成的心肌组织损伤是否具有保护作用尚无相关研究。

心肌细胞受到损伤时，细胞膜通透性增强，细胞内的某些酶释放入血，血清中这些酶活力的升高程度则反映出了心肌坏死的程度[20]。本研究首先通过测定血清中LDH和CK-MB的变化，观察7,8-DHF预处理对缺血心肌损伤的保护作用。结果显示，I/R组大鼠血清中LDH和CK-MB的活力均明显升高，7,8-DHF预处理则部分抑制了上述变化，提示7,8-DHF预处理对再灌注的心肌组织具有一定的保护作用。为了进一步探讨7,8-DHF保护作用的机制，本研究通过检测Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达来评估心肌细胞凋亡的发生[21]。结果显示，I/R组大鼠心肌组织中Bcl-2蛋白表达降低，Bax和cleaved caspase-3蛋白表达升高，提示I/R大鼠心肌存在明显的细胞凋亡，7,8-DHF预处理可显著逆转上述变化，进一步验证了7,8-DHF的心肌保护作用，并且表明该作用与其抑制心肌细胞凋亡有关。本研究结果为7,8-DHF应用于心肌I/R损伤的防治提供了一定的实验依据。