黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

沈玉珏

(邯郸市中心医院,河北 邯郸 056000)

冠心病的患病人群逐年增加，其引发的心肌梗死成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。中药黄芪味甘、性温，具有补气固表、敛汗固脱、托疮生肌、利水消肿之功效。黄芪多糖(Astraglus polysaccharides，APS)为黄芪的主要活性成分，由葡萄糖、果糖、己糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等组成，具有抗氧化、抗凋亡、提高免疫力等多种药理学作用[1-2]。目前，APS在临床上主要用于白细胞减少、免疫功能低下的肿瘤患者的辅助治疗。近年来研究发现，APS对缺血性肾损伤后细胞凋亡和成肌细胞损伤后细胞自噬均具有抑制作用[3-4]。

及早恢复缺血区心肌血流灌注是改善心肌梗死预后的关键，而细胞凋亡与自噬是心肌梗死后细胞死亡的重要病理机制[5-6]。本课题组既往研究发现APS能够通过抑制氧化应激保护缺氧/复氧(Hypoxia/reoxygenation，H/R)损伤乳鼠心肌细胞[7]，但APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬的影响尚未见文献报道。本研究旨在探究APS对H/R所致心肌细胞凋亡与自噬的影响并初探其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级SD大鼠乳鼠(出生时间<24 h)，购自河北省实验动物中心[SCXK(冀)2018-004]。

1.2 药物与试剂 APS(西安沃森生物科技有限公司)；DMEM培养基、Annexin V-FITC/PI试剂盒(美国GIBCO公司)；CCK-8试剂盒、BCA试剂盒、ECL化学发光试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated protein1 light chain 3,LC3)、P62、β-actin抗体(北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 主要仪器 ZHJH-C1115B型超净工作台(上海智成分析仪器制造有限公司)；Labofuge 400R型低温离心机(德国Thermo Electron公司)；RAcell 150型CO2培养箱(德国Beraeus公司)；RT-6100型酶标仪(美国Rayto公司)；1659001型电泳仪、1703940型转膜仪、Chem Doc XRS型凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 乳鼠心肌细胞分离与培养：参照文献[8]报道，无菌环境取乳鼠左心室组织经胰酶消化处理后过200目筛，以含10%胎牛血清的DMEM培养基制备单细胞悬液，壁立1 h后收集未贴壁细胞，调整细胞浓度为6×105个/ml，接种于 35 mm培养皿，置37 ℃、5% CO2、100%湿度细胞培养箱中培养。

1.4.2 乳鼠心肌细胞分组、给药与H/R损伤细胞模型制备：取对数生长期细胞调整浓度为6×105个/ml，设置正常组、H/R组和APS低、中、高剂量组，每组10皿；造模前30 min，APS低、中、高剂量分别滴加终浓度20、40、80 μmol/ml的APS溶液进行干预，正常组和H/R组不做处理。模型制备：参照文献[9]报道的方法，H/R组和APS低、中、高剂量组更换无糖DMEM培养基，置缺氧盒中，缺氧盒通入流速为1 L/min的95% N2和5% CO2混合气15 min后置细胞培养箱2.5 h为缺氧过程，然后从缺氧盒中取出并更换含糖DMEM培养基，置37 ℃、5% CO2、100%湿度培养箱，即复氧，2 h检测各指标。

1.4.3 细胞增殖抑制率检测：各组细胞经胰酶消化和重悬后制备浓度6×105个/ml的单细胞悬液，以100 μl/孔接种于96孔培养板，每组10个复孔，以10 μl/孔加入浓度10%的CCK-8溶液，置培养箱继续培养2 h，胰酶消化并离心收集细胞，然后通过酶标仪检测570 nm处吸光度值(A)，增殖抑制率(%)=(1-A药物组/A正常组)×100%。

1.4.4 细胞凋亡水平检测：取各组离心收集的细胞，按照Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒说明，滴加稀释后的结合缓冲液重悬细胞，滴加Annexin V-FITC和PI染液，37 ℃避光孵育15 min后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.4.5 细胞蛋白水平检测：取各组离心收集的细胞，滴加RIPA蛋白裂解液于冰上裂解30 min后，4 ℃、12000 r/min离心30 min，取上清液，检测蛋白浓度后行高温变性，电泳、转膜、封闭处理后滴加目标蛋白和β-actin抗体4 ℃孵育过夜，然后二抗37 ℃孵育1 h后滴加DAB显色，通过条带灰度值计算蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞增殖的影响 见表1。H/R组细胞增殖抑制率较正常组显著升高(P<0.01)；APS中、高剂量组增殖抑制率较H/R组显著降低(P<0.01)。

2.2 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞凋亡的影响 见表1。H/R组细胞凋亡率较正常组显著升高(P<0.01)；APS低、中、高剂量组细胞凋亡率较H/R组显著降低(P<0.05或P<0.01)。

表1 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞增殖和凋亡的影响(%)

2.3 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量的影响 见表2(图1)。H/R组p-Akt、p-mTOR相对表达量较正常组显著降低(P<0.01)；APS低、中、高剂量组p-Akt、p-mTOR相对表达量较H/R组显著升高(P<0.05或P<0.01)。

A：正常组；B：H/R组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组图1 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达的影响

表2 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量的影响

2.4 APS对H/R损伤相对乳鼠心肌细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量的影响 见表3(图2)。H/R组细胞Cleaved Caspase-3、Bax蛋白相对表达量较正常组显著升高，而Bcl-2相对表达量较正常组显著降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值较正常组显著降低(P<0.01)；与H/R组比较，APS中、高剂量组Cleaved Caspase-3、Bax相对表达量降低且Bcl-2表达量升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.01)。

A：正常组；B：H/R组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组图2 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

表3 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相对表达量和Bcl-2/Bax比值的影响

2.5 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞Beclin1、LC3、P62蛋白相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影响 见表4(图3)。H/R组细胞Beclin1、LC3(LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)、P62蛋白相对表达量较正常组显著升高(P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值较正常组显著升高(P<0.01)；APS中、高剂量组Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bax相对表达量较H/R组显著降低，且Bcl-2表达量显著升高(P<0.05或P<0.01)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值较H/R组显著降低(P<0.01)。

A：正常组；B：H/R组；C：APS低剂量组；D：APS中剂量组；E：APS高剂量组图3 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞Beclin1、LC3、P62蛋白表达的影响

表4 APS对H/R损伤乳鼠心肌细胞Beclin1、LC3、P62蛋白相对表达量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的影响

3 讨 论

通过药物溶栓或介入手术及时恢复血流灌注是临床抢救心肌梗死患者的关键。但实现血流再灌注后将引发活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)大量释放并诱导心肌细胞凋亡与自噬，从而严重影响心肌梗死治疗预后[10-12]。本研究发现，经APS干预能够有效降低H/R损伤乳鼠心肌细胞增殖抑制率和凋亡率，提示APS对H/R致心肌细胞凋亡具有抑制作用。

Bcl-2家族(Bcl-2、Bax)和Caspase-3蛋白参与细胞凋亡过程调节，其中Bcl-2蛋白具有其通透性的生理学作用；缺氧复氧能够病理性刺激Bax移位线粒体膜，导致其通透性升高而过度释放细胞色素C(Cyt C)[13-15]。Bax与Bcl-2结合成二聚体而致使二者失去生理活性，因此计算Bax/Bcl-2比值对阐明二者在细胞凋亡中所起的作用具有一定意义[16]。本研究发现，APS能够下调Cleaved Caspase-3、Bax表达并上调Bcl-2表达，提高Bcl-2/Bax比值，这可能是APS抑制H/R损伤乳鼠心肌细胞凋亡的分子机制。

LC3表达于自噬体膜，有LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ两种亚型，LC3-Ⅱ通过线粒体途径具有促细胞自噬作用[17]。Beclin1通过转运自噬蛋白而间接发挥促细胞自噬作用[18]。P62能够诱导靶蛋白泛素化，进而被自噬体包裹而降解，并且能够与非泛素化蛋白聚集体结合而诱导其被自噬清除[19]。本研究提示APS具有抑制H/R损伤乳鼠心肌细胞自噬的作用，其机制可能与下调Beclin1、LC3-Ⅱ、P62蛋白表达有关。

Akt是一种存在于机体各细胞中原癌基因，p-Akt能够磷酸化Cleaved Caspase-3使其失去生理活性，并可抑制Bax蛋白表达[20]。本研究发现，APS能够上调p-Akt、p-mTOR表达，激活Akt/mTOR通路。

综上所述，APS能够通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达，对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。