加味大黄虫颗粒对精索静脉曲张模型大鼠精子线粒体结构的影响

卢森宝，王权胜，莫宏芳，蒙帅杰，杨德芬，代 波，郑翼弛

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023)

根据数据统计，全球范围内已婚夫妇因各种原因引起的不孕不育率已高达15%，而因精索静脉曲张引起的不育症约占25%以上[1]。精索静脉曲张(Varicocele，VC)导致不育症的可能病理原因是因为血管病变导致睾丸组织局部血液循环障碍，局部温度升高，物质代谢异常引起支持细胞损伤、氧化应激损伤、生精细胞凋亡等[2]。对比现代医学治疗手段，中医以补肾祛瘀法[3]对精索静脉曲张性不育症的治疗有一定的特色。我们立足于《金匮要略·血虚虚劳病第六篇》的理论基础，认为精索静脉曲张导致不育症的主要病因病机是肾虚血瘀，以致“营气不从，肾精亏虚”。使用加味大黄虫颗粒治疗，能祛瘀通闭，补肾生精。前期的实验研究及临床治疗得到一定的效果[4-5]。本实验研究在现有基础上，使用加味大黄虫颗粒治疗VC大鼠模型，观察其对VC大鼠模型精子质量及线粒体结构的影响，深入探索其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 从广西医科大学动物实验中心购买40只雄性大鼠，8～10周龄，体重在180～210 g之间,动物许可证号[SCXK(桂)2019-0003]。随机选取10只大鼠为假手术组，剩余30只大鼠按照随机数字表法分为迈之灵组10只、加味大黄虫颗粒组10只、模型组10只。适应性饲养1周，每天按时投放饲料、饮用水、自由饮食。木屑垫料，保持垫料干燥清洁。环境温度23～25 ℃，自然光照。

1.2 实验设备与试剂 精子质量检测系统WLJY-9000和精子计数板MACRO(北京新世界科技发展公司)，光学生物显微镜，型号DM3000(德国 LEICA 公司)由广西中医药大学男科实验室提供。透射电子显微镜型号TECNAIG20TWIN；图像采集软件：Leica Application Suite V4，病理组织烤片机TEC2602型(德国FEI公司)，由广西医科大学电镜室观察分析。

1.4 动物造模与给药方法 所有大鼠均适应性喂养1周后，按照Turner深静脉缩窄术[6]进行造模。造模成功后，加味大黄虫颗粒组给予浓度为2.4 g/ml的颗粒冲剂灌胃，假手术组和模型组予以等量的生理盐水进行灌胃，迈之灵组则予54 mg/kg迈之灵片，各组均按照每100 g体重给予1 ml药液灌胃，灌胃8周。

1.5 实验室观察及检测方法

1.5.1 取材方法：末次给药24 h后，将大鼠称重，然后头颈脱臼法处死大鼠，迅速开腹取出左侧睾丸组织，用生理盐水冲洗，除去血液。将大鼠睾丸分别固定在Bouin溶液中24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规石蜡切片包埋，HE染色，做睾丸组织HE染色检测和电镜备检用。

1.5.2 睾丸精子质量相关参数分析：取大鼠左侧睾丸组织，置于5 ml生理盐水，在预制37 ℃条件下剪碎、混匀，静置15 min，使精子游离出。采用精子计数板检测精子浓度、总活率及运动指数。按照WHO《人类精液检查与处理实验室检验手册》第五版[7]标准，测定精液质量相关参数。

1.5.3 透视电镜制片及观察方法：取1～2 mm3睾丸组织，加入2.5%戊二醛，于4 ℃保存,经锇酸固定，酒精脱水，渗透剂(丙酮、环氧树脂)渗透，将渗透好的组织放入包埋板中用环氧树脂聚合48 h后予超薄切片机切片80～100 nm，经铀铅双染色，最后用电镜观察。

1.5.4 HE染色法检测：睾丸组织切片行苏木精-伊红(HE)染色,每组制作10张切片,每张切片随机取两个视野观察睾丸组织(×200,每组观察20个视野)。在睾丸生精小管的15个横切面进行观察和评价。

1.6 统计学方法 采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，数据以均数±标准差进行单因素方差分析，组间比较使用LSD检验和χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 造模后大鼠动物外观体征和行为表现 造模后1周内各组大鼠均出现不同程度活动减少,食欲下降，畏惧感增加等表现，1周后上述情况逐渐好转。在造模过程中因注射麻药出现死亡2只(模型组1只、大黄虫颗粒组1只)，喂养过程中因大鼠相互撕咬打斗死亡2只(迈之灵组1只，模型组1只)。

2.2 各组大鼠治疗8周后附睾精子质量比较 见表1。与假手术组比较，模型组的大鼠附睾精子浓度、精子总活率、前向运动精子百分比下降明显(P<0.05)；与模型组比较，加味大黄虫颗粒组精子浓度、精子总活率、前向运动精子百分比均升高(均P<0.05)。

2.3 各组大鼠治疗8周后附睾精子运动参数比较 见表2。与假手术组比较，模型组的大鼠精子直线速度(VSL)、精子曲线速度(VCL)、平均路径速度(VAP)、精子头侧摆幅度(ALH)下降明显，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，大黄虫颗粒组VSL、VCL、VAP、ALH均升高(P<0.05)。

2.4 各组大鼠睾丸组织HE染色结果 各组大鼠睾丸组织HE染色报告显示(图1)，假手术组生精小管在光学显微镜下可见，生精上皮中精原细胞，初级及次级精母细胞和精子细胞、各期生精细胞排列整齐，结构正常，管腔内存在超过20个成熟精子/生精小管，精子释放良好。说明睾丸精子生成功能良好。加味大黄虫颗粒组可见生精小管部分萎缩，生精上皮中精原细胞，初级及次级精母细胞、精子细胞、各期生精细胞排列始于紊乱，管腔有脱落的生精细胞或管腔轻微阻塞，有超过20个成熟精子/生精小管，精子释放可。说明睾丸精子生成功能降低。迈之灵组生精上皮中精原细胞，初级及次级精母细胞、精子细胞、各期生精细胞排列紊乱，细胞变性，管腔有脱落的生精细胞或管腔轻微阻塞，有少于20个成熟精子/生精小管，精子释放不良。说明睾丸精子生成功能降低。模型组生精小管发育不良，管腔空化，生精上皮中各期生精细胞凋亡严重，说明精子细胞分化障碍，精子生成低下，无精子症。

表1 各组大鼠治疗8周后附睾精子质量比较

表2 各组大鼠治疗8周后附睾精子运动参数比较

A：假手术组；B：加味大黄虫颗粒组；C：迈之灵组；D：模型组图1 各组大鼠光镜下睾丸组织结构变化 (HE染色，×200)

2.5 各组大鼠精子线粒体电镜病理结果 各组大鼠精子线粒体电镜病理报告显示(图2)，假手术组,电镜下精子形态结构良好，精子线粒体有序规则排列于精子两侧，以卵圆形线粒体为主，相邻线粒体膜分界清晰，线粒体外模完整。加味大黄虫颗粒组精子线粒体在电镜下可见线粒体排列有序，但部分线粒体发育异常，大小长短不一，线粒体结构、形态基本正常。迈之灵组精子结构不完整，精子膜破裂，线粒体排列紊乱，线粒体形态、结构基本正常。模型组精子未见完整线粒体结构，线粒体结构破坏、线粒体溶解消失等。

A:假手术组;B:加味大黄虫颗粒组;C:迈之灵组；D:模型组图2 各组大鼠电镜下精子线粒体结构变化(×5000)

3 讨 论

根据WTO统计显示，VC是引起不育症的首要原因[8]，随着中国地区男性不育症发病率逐年增高[9]，男性不育问题应该受到更多的关注与研究。VC会导致睾丸局部血液循环障碍，出现睾丸供血不足，生精小管基膜和间质小血管免疫复合物沉积增加，间质细胞损伤和睾丸局部温度增加，生精小管正常的物质交换出现障碍，影响精子产生[10]。当精子代谢底物不足时，精子线粒体的功能会出现紊乱，不能产生足够的能量维持精子正常的活动，影响精子的精子活力及受精能力[11]。

线粒体是产生三磷酸腺苷(ATP)的细胞器，为生物体能量代谢合成ATP，维持生命体的生命活动。不同于体细胞线粒体，精子线粒体主要包裹于精子中段轴丝周围，形成纤维鞘[12]，精子线粒体鞘是精子分解营养物质和合产生能量的主要场所，精子线粒体具有多种代谢通路如脂肪酸的β-氧化、氨基酸代谢等，使得精子能够利用不同的代谢底物进行利用，正是精子线粒体的这种结构特殊性与功能多样性，是维持精子发育与精子运动稳定的能量来源，是确保精子受精能力的关键[13]。精子线粒体的功能不仅是合成ATP，还参与精子超激活运动、精子获能、顶体反应、调整钙离子稳态，调控细胞凋亡到最终受精等多种生理过程。在正常的精子线粒体中，由三磷酸循环产生的ATP传递给电子，同时将质子从线粒体内膜的基质侧泵到内膜侧，形成跨膜电位差,线粒体膜结构的完整性是跨膜电位形成必要条件。线粒体膜电位反映了线粒体的能量状态，是反映线粒体功能的主要指标[14]。线粒体结构与功能的完整性与精子的运动、获能、顶体反应及受精能力关系密切[15]。当精子线粒体的结构与功能的损伤，将影响线粒体氧化磷酸化合成ATP，使得精子运动及受精所需的能量出现供给不足，对精子发生、发育过程造成很大影响，导致精子活力低下及受精能力下降等，最终可能导致不育。

我们认为VC性不育症主要在肾，与肝脾有关，肾虚血瘀，气血运行不畅，经脉瘀滞，加之肝脾不调，以致“营气不从，肾精亏虚”[16-19]。我们立论于“虚劳干血”，润以濡其干，虫以动其瘀，通以去其闭的治疗思想，运用加味大黄虫颗粒治疗。本方原出自张仲景大黄虫丸，具有活血化瘀、益气养阴、补肾填精之功效。现代药理研究表明本方药物具有的抗炎、抗凝、溶栓、抗氧化、拮抗生精细胞凋亡等功效[20-23]。前期的实验研究表明，加味大黄虫颗粒能改善精索静脉曲张大鼠睾丸的病理损伤,提升睾丸组织中Nrf2的蛋白表达,有利于精子的发生发育[24]；加味大黄虫颗粒能有效抑制精索静脉曲张引起的睾丸组织损伤,修复睾丸的氧化应激伤害,降低生精细胞的凋亡率，起到维护精子发生的内环境作用，有利于提高精子质量[25]。