淫羊藿素对腹膜纤维化大鼠糖原合酶激酶3β、β连环蛋白的影响

李林煜，陈 烨，甘 平

(1.贵州医科大学，贵州 贵阳550000；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳550004)

腹膜透析(Peritoneal dialysis，PD)是一种治疗终末期肾病(End-stage renal disease，ESRD)经济有效的肾脏替代疗法[1]。但腹膜组织长期暴露于生物不相容的高葡萄糖PD液(PDF)会使腹膜进行性损伤，导致腹膜纤维化[2]。目前腹膜纤维化的发生机制尚不清楚，尚无有效的治疗方法。关于腹膜纤维化的发病机制中医学目前没有相关的描述，但一些医学家认为腹膜纤维化的中医发病机制为脾肾亏虚、痰瘀互结等。研究显示淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物，是一种传统中草药，具有增强人体免疫功能、延缓衰老、防治神经性疾病等作用，淫羊藿素是从淫羊藿中提取的一种异戊二烯类黄酮衍生物，具有抗肿瘤、抗骨质疏松等作用[3]。目前尚不了解淫羊藿素在透析诱导的腹膜纤维化中的抗纤维化作用。β连环蛋白(β-catenin)信号在体内自我更新中发挥重要作用，在肾脏纤维化、肺纤维化、肝纤维化和皮肤纤维化中涉及上皮间充质转化的启动[4-6]。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)在上述病理中抑制β-catenin信号传导中起关键作用[7]。由此，本研究拟探讨淫羊藿素对腹膜纤维化的作用效果及对GSK-3β、β-catenin的影响，为淫羊藿素治疗腹膜纤维化的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物:成年雄性SPF级SD大鼠30只，体重(210±10)g。购于成都达硕实验动物有限公司，使用许可证号：SCXK(川)2019-031。饲养于恒温(20～25 ℃)、恒湿(50±5)%环境中，自然采光，自由饮水。

1.1.2 主要试剂及仪器:淫羊藿素购自上海友思生物技术公司；0.1%葡萄糖氯已定购于美国Sigma；苏木素染液(批号：C200301)、伊红染液(批号：C200403)购自珠海贝索生物技术有限公司；改良Masson三色染色液(批号：0630A20)购自合肥博美生物科技有限责任公司；GSK-3β、β-Catenin ELISA试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司；相关一抗GSK-3β、β-catenin、p-GSK-3β购自CST，二抗购自英国Abcam公司；RS36型全自动染色机购自常州派斯杰医疗设备公司；病理组织漂烘仪(PHY-Ⅲ型)购自常州市中威电子仪器；BA210Digital数码三目摄像显微镜购自麦克奥迪实业集团。

1.2 实验方法

1.2.1 腹膜纤维化大鼠模型构建及干预方法:大鼠适应性饲养7 d后，随机分为假手术组(10只)及造模组(20只)。模型组每日给予0.1%葡萄糖氯已定(1 ml/100 g)腹腔注射，假手术组每日给予1 ml生理盐水腹腔注射，连续21 d。21 d后造模大鼠随机分为模型组、淫羊藿素组，随后假手术组和模型组大鼠灌胃生理盐水，淫羊藿素组按3 mg/kg淫羊藿素灌胃，淫羊藿素剂量选择是根据前期体内淫羊藿素(0.1～10 mg/kg)处理的预实验结果选用3 mg/kg剂量给药，每天给药1次，持续6周。

1.2.2 标本采集:三组大鼠于末次给药结束24 h后，处死大鼠，分别取腹膜组织，将腹膜组织分为三部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，用于病理观察及免疫组化染色；另一部分于-80 ℃冰箱保存，用于ELISA检测；剩余部分于液氮中保存，用于后续Western blot检测。

1.2.3 腹膜组织病理变化观察:HE染色方法为，腹膜组织4%多聚甲醛固定，包埋在石蜡中，然后切成切片(约5 μm厚)，根据说明书对样品进行了苏木精-伊红(HE)染色，观察腹膜组织的病理变化，并用光学显微镜拍照。Masson染色：腹膜组织4%多聚甲醛固定，包埋在石蜡中，切成5 μm的横截面，使用Masson的三色染色剂，将腹膜组织分别染成红色和蓝色，观察腹膜组织胶原纤维变化，并用光学显微镜拍照。

1.2.4 免疫组织化学法:固定的腹膜组织脱水，包埋，切片，使用磷酸盐缓冲液(PBS)中的0.3%过氧化氢抑制这些切片中的内源性过氧化物酶活性，并用10%的正常山羊血清封闭非特异性蛋白结合位点。然后将切片与抗GSK-3β、抗β-catenin抗体4 ℃过夜，后与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgGs二抗37 ℃孵育30 min，苏木素染色，镜检观察，并使用Image-J图像分析软件根据积分光密度(IOD)/面积值确定GSK-3β、β-catenin阳性染色的强度。

1.2.5 ELISA检测:取腹膜组织，剪碎后加入预冷的生理盐水3 ml，4 ℃下研磨，3500 r/min低温离心10 min，取上清液，用于分析GSK-3β、β-catenin含量。通过相应的ELISA分析试剂盒检测，所有步骤均按照说明书进行。设空白孔、标准品孔、待测样品孔，其中空白孔不加样品，只加显色剂A、B和终止液用于调零；标准品孔加入配好的标准品50 μl，然后加入辣根过氧化物酶100 μl；待测样品孔加入样本50 μl，然后辣根过氧化物酶100 μl，盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37 ℃温育60 min。揭膜，弃去液体，于每孔加满洗涤液后静置1 min，弃去液体，重复5次。每孔先加入底物液A 50 μl，再加入底物液B 50 μl，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应。在15 min内，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.2.6 Western blot分析:将每个样品在裂解缓冲液中裂解以获得总蛋白质，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离该蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在5%脱脂牛奶中封闭60 min后，将膜与一抗GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、β-actin在4 ℃孵育过夜。然后将膜用tris缓冲盐水Tween(TBST)洗涤，并与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗兔或抗小鼠二抗在室温下孵育1 h。使用增强的化学发光检测试剂观察蛋白条带，并使用Image-J软件通过光密度法定量。条带的灰度值标准化为β-actin，并表示为相对于对照的倍数变化，实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行分析，试验数据均以均数±标准差表示，组间差异采用t检验统计分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠腹膜组织病理变化 假手术组：腹膜组织结构较为完整、清晰，未见明显增厚；表面被覆单层扁平上皮，排列较为整齐，间皮下可见疏松结缔组织，未见明显纤维增生或炎细胞浸润；腹膜下肌束结构清晰，肌束内肌细胞呈长圆柱状，胞核呈扁圆形或椭圆形，位于细胞周缘，胞质染色较为均匀，未见明显变性坏死。模型组：腹膜组织明显增厚，间皮细胞排列紊乱；间皮下大量纤维组织增生，胶原纤维增多，腹膜组织厚度增加，增生纤维组织较为致密，平行排列成束，成纤维细胞、纤维细胞穿插于纤维束间，增生区域内可见大量血管增生及淋巴细胞浸润，局部血管充血扩张较为明显；腹膜下肌细胞变性坏死，见肌细胞基本结构丢失，大量肌细胞萎缩溶解。淫羊藿素组：腹膜组织增厚，纤维组织不同程度增生，可见成纤维细胞或淋巴细胞聚集于新生纤维束间；腹膜下部分肌细胞变性，见肌细胞轻微萎缩，腹膜组织间皮下致密层增厚程度减轻，胶原纤维较模型组减少(图1)。

图1 各组大鼠腹膜组织病理变化(×400)

2.2 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达比较 见表1(图2)。与假手术组比较，模型组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin蛋白含量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，淫羊藿素组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin蛋白含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达比较

图2 各组大鼠GSK-3β、β-catenin免疫组化染色图(IHC染色，×200)

2.3 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin含量比较 见表2。与假手术组比较，模型组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin水平明显升高(P<0.01)。与模型组比较，淫羊藿素组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin水平明显降低(P<0.05)。

表2 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、β-catenin含量比较

2.4 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达比较 见表3(图3)。与假手术组比较，模型组大鼠腹膜组织中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达明显升高(P<0.05)；与模型组比较，淫羊藿素组大鼠腹膜组织中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达明显降低(P<0.05)。

表3 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白相对表达比较

图3 各组大鼠腹膜组织GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白表达

3 讨 论

腹膜纤维化是长期腹膜透析(PD)引起的严重并发症，其特征是间皮细胞丢失和细胞外基质沉积[8]，因此开发腹膜纤维化的潜在治疗策略尤为重要。中医认为腹膜纤维化的发病机制为脾肾亏虚、痰瘀互结、久病入络，从而导致腹络微型癥积。

淫羊藿(Epimedium brevicomu Maxim.)又名仙灵脾、阴阳活、铜丝草、巴伦草，味甘、辛，性温，归肾、肝经，《玉楸药解》注其功效：“荣筋强骨，起痿壮阳，温补肝肾，滋益精血，治阴绝不生，阳痿不举，消瘰疬，起瘫痪，益志宁神，清风明目”[9]。《本草纲目》认为淫羊藿有“益精气，坚筋骨，补腰膝，强心力”之功效，对于肾阳虚导致的骨质疏松症疗效显著。因此，淫羊藿也被广泛用于治疗绝经后骨质疏松症[10]。淫羊藿最早记载见于《神农本草经》，药理作用有补肾壮阳、祛风除湿等，现代医学研究表明淫羊藿素已被临床证明对一系列肿瘤、骨质疏松等疾病有效，此外，在神经保护、心脏保护、抗炎、抗肝纤维化等方面具有显著药理作用[11]。研究报道淫羊藿素可显著抑制血清促炎细胞因子的分泌和产生，包括前列腺转腺癌小鼠中的白细胞介素(IL-1α、IL-β、IL-6)和肿瘤坏死因子TNF-α[12]。此外，淫羊藿素还可通过激活5’-单磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMPK)并抑制β位点APP裂解酶1(BACE-1)发挥抗阿尔茨海默氏症作用[13]。Zhao等[14]发现淫羊藿素通过抑制IL-6和TNF-α的表达并通过AMPK/mTOR信号通路抑制肺癌破骨细胞的形成。Hwang等[15]报道淫羊藿素可通过刺激Nrf2/ARE和降低AP-1和NF-κB信号通路恢复UVB诱导的光老化。淫羊藿素还可调节硬化素的表达，促进骨髓间充质干细胞的成骨[16]。但淫羊藿素对腹膜纤维化的保护作用机制尚不清楚。因此，本研究建立腹膜纤维化大鼠，观察淫羊藿素抗纤维化作用。首先从病理角度观察结果显示淫羊藿素可减轻腹膜增厚，减轻间皮下大量纤维组织增生，改善局部血管充血扩张，并减少腹膜组织胶原纤维。提示淫羊藿素对腹膜纤维化具有改善作用，可成为治疗腹膜纤维化的潜在治疗药物。

淫羊藿素已被表明可通过多靶点，多途径作用于各种疾病[11]。研究报道GSK-3β是Wnt信号通路中的重要信号因子，在各种细胞内均广泛存在，可通过Wnt信号通路调节细胞的代谢、增殖和凋亡等多种进程[17]。Zhang等[18]证实GSK-3β在纤维化中占有重要作用，抑制GSK-3β的表达可以抑制肺纤维化的发生与进展，并提出GSK-3β可能是肺纤维化治疗的一个潜在靶点。β-catenin是通过Axin、腺瘤性息肉病大肠杆菌、酪蛋白激酶1α(CK1α)和GSK-3β组成的破坏复合体维持在较低水平，GSK-3β磷酸化抑制破坏复合物的泛素化活性，导致胞内β-catenin的积聚，随后迁移到细胞核[19]。核β-catenin与T细胞因子/淋巴增强因子结合因子(TCF/LEF)家族成员形成复合物，刺激靶基因的转录，包括Snail、Twist、纤维连接蛋白(fibronectin)、MMPs、Jagged1和LEF1，促进细胞增殖[20]。研究表明抑制β-catenin可阻断高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化[21]。Yan等[22]研究表明β-catenin通路可能在高糖诱导的腹膜纤维化过程中促进腹膜间质转化。本研究表明，淫羊藿素可抑制葡糖糖氯已定诱导的腹膜纤维化大鼠GSK-3β、β-catenin表达，提示淫羊藿素可能通过抑制GSK-3β的磷酸化，促进GSK-3β降解，减少β-catenin蓄积，减轻腹膜纤维化。

综上所述，淫羊藿素通过减轻腹膜增厚及腹膜组织胶原纤维进展，抑制GSK-3β/β-catenin轴的激活，减轻葡糖糖氯已定诱导的腹膜纤维化。