新型苦参酸-氨基甾体化合物对人髓性白血病K562细胞增殖的抑制作用

2021-05-17 03:59杨瑞虹郝志英徐变珍李慧芳
山西卫生健康职业学院学报 2021年6期
关键词:苦参碱苦参抑制率

杨瑞虹,何 群,郝志英,徐变珍,李慧芳,徐 珍

(1.山西卫生健康职业学院,山西 晋中 030619;2.中南大学湘雅医学院,湖南 长沙 410078;3.山西省肿瘤医院,山西 太原 030000)

苦参碱系从中药苦参中提取分离出的生物碱,现代药理研究表明苦参碱在保护肝脏和心脑血管、抗病毒、免疫调节等方面具有重要的临床应用价值[1,2]。近年来大量的体内外研究证实,苦参碱能有效抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞分化,在抗肿瘤方面具有明显功效[2,3]。研究证实氨基甾体化合物对慢性髓性白血病K562细胞具有抑制增殖和诱导分化作用[4]。利用药物拼合原理,将苦参碱的水解产物苦参酸与氨基甾体成酯,所得产物为新化合物,目前尚未有关有该化合物的研究报道,由于合成所用的两个化合物均具有抗肿瘤活性,有望产生协同作用,提高苦参碱的抗肿瘤活性。结合苦参碱和氨基甾体化合物的抗瘤谱,选择人髓性白血病K562细胞株为体外试验细胞,K562细胞系建于CML急变期的患者,是第一个人类髓性白血病人工培养的细胞,已广泛用作研究白血病的细胞模型[3-6]。本试验旨在研究苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH)对人髓性白血病K562细胞株增值及分化的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

K562细胞由中南大学湘雅医学院血液生理研究室提供,RPMI1640培养基(美国GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料公司),琼脂(美国Sigma),MTT试剂盒(美国Sigma),流式细胞仪(美国Beckman公司),多功能酶标仪(美国Thermo公司),苦参碱(KSJ 大连美仑生物技术有限公司,批号:110805-201709),苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH 课题组自制),氨基甾体化合物(KH 中南大学湘雅医学院血液生理研究室提供)

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 K562细胞株由中南大学湘雅医学院血液生理研究室传代保存,将K562细胞加入含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中,置于培养箱(37℃,5%CO2)中,饱和湿度培养。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 样品溶液配制及实验分组 RPMI1640培养基用无菌双蒸水溶解,碳酸氢钠调pH值至7.2~7.4,滤过除菌备用;KH、KSS-KH、 KSJ.KH(苦参碱和氨基甾体1∶1混合物)用二甲基亚砜(DMSO)分别配置成10-1M的储备液,再用上述RPMI1640培养基分别稀释成(10-4~10-8)为三个实验组;空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基。

1.2.3 样品对K562细胞液体培养的影响 取对数生长期细胞以每mL 5×104个加入培养体系,三个实验组分别加入不同浓度(10-4~10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH,空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基,接种1 mL于24孔板中,每组平行接种3孔,培养5 d,用MTT计数细胞数,实验重复3次。

1.2.4 MTT比色法测定样品对细胞增殖抑制作用 采用96孔板培养K562细胞,使每mL含5×104个细胞;三个实验组分别加入不同浓度(10-4~10-8)的KH、KSS-KH、 KSJ.KH,空白对照组加入实验组等量的RPMI1640培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中,饱和湿度培养5 d,离心、吸去上清;每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),继续培养4 h,离心、吸去上清;每孔加入100 μL DMSO,低速震荡10 min,使甲瓒结晶物充分溶解;用酶联免疫检测仪,以溶剂DMSO孔为空白,在590 nm波长下测定各孔的吸光度(OD值),计算细胞增殖抑制率。实验重复三次。

1.2.5 瑞氏染色观察细胞形态 将105个K562细胞加入10 mL含10%新生牛血清的RPMI1640培养基中;实验组分别加入不同浓度(10-4~10-8)的KSS-KH,空白组加入实验组等量的RPMI1640培养基,置于培养箱(37℃,5%CO2)中,饱和湿度培养5 d,离心收集细胞,涂片,滴加瑞氏染液,固定细胞约1 min,再滴加等量PBS (pH值至6.4~6.8)缓冲液,使染液充分混匀,染色10 min,冲洗、凉干、镜检,观察细胞形态的变化。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 对K562细胞增殖的抑制作用 KSS-KH、KH、KSJ.KH对细胞增殖的影响见表1,剂量抑制曲线见图1。

表1 不同浓度药物对K562细胞MTT值的影响

图1 不同浓度药物对K562细胞增殖抑制的影响

2.1.1 不同浓度氨基甾体化合物(KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KH处理K562细胞5 d后,细胞增殖抑制率随着药物的浓度增加而升高,各浓度抑制率具有显著的差异性(P<0.05),10-8M对K562细胞即有抑制作用,10-5M细胞增殖抑制率显著提高(22.3%),10-4M细胞增殖抑制率达到94.1%。

2.1.2 不同浓度苦参碱和氨基甾体(1∶1)混和物(KSJ.KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KSJ.KH处理K562细胞5 d后,细胞增殖抑制率随着药物的浓度增加而升高,各浓度抑制率具有显著的差异性(P<0.05),10-4M对细胞增殖抑制作用与单独使用KH接近,说明苦参碱和氨基甾体联合使用,仅具有相加作用,但不呈现协同作用。

2.1.3 不同浓度苦参酸氨基甾体化合物(KSS-KH)对K562细胞的增殖抑制作用 不同浓度KSS-KH处理K562细胞5 d后,结果显示10-8~10-6M与对照组无显著差异(P>0.05),10-8M对K562细胞无抑制作用,10-7~10-5M细胞增殖抑制率均低于单独使用KH及苦参碱和氨基甾体混和物(KSJ.KH),但10-4M对细胞增殖的抑制作用显著提高(98.8%),与其他各浓度抑制率具有显著差异性(P<0.05),说明KSS-KH在较高浓度下对K562细胞具有较强的抑制作用。

2.1.4 比较相同药物浓度下,不同实验组之间的差异 在10-8~10-5M 各实验组间对细胞的抑制率有显著差异(P<0.05);10-4M浓度下KH和KSJ.KH之间无显著差异,但KSS-KH与KH、KSJ.KH组间有显著差异(P<0.05),说明在较高浓度下苦参酸氨基甾体化合物(KSS-KH)对K562细胞增殖的抑制率明显强于其他两组。

2.2 瑞氏染色观察细胞形态

K562细胞经处理,采用瑞氏染色,观察细胞形态。对照组未经药物处理,K562细胞呈圆形或椭圆形,细胞核和胞浆无明显界线,细胞浆呈蓝紫色;实验组经KSS-KH(10-6M)处理后,细胞体积增大、细胞染色质变浅,细胞核浆比变小,呈现分化特征见图2。

图2 K562细胞形态对比(A.未经药物处理的细胞;B.经10-6 KSS-KH处理的细胞)

3 讨论

慢性髓性白血病(CML)又称为慢性粒细胞白血病,是造血干细胞恶性克隆性疾病,以髓系细胞恶性增殖为特点,K562细胞系研究慢性髓性白血病的细胞模型。本试验将目标化合物苦参酸-氨基甾体(KSS-KH)与氨基甾体(KH)、苦参碱氨基甾体混合物(KSJ.KH)对K562细胞抑制作用进行比较,结果发现将苦参酸-氨基甾体化合物对K562具有较强的抑制作用,说明将苦参碱水解,与氨基甾体形成酯,两种药物可能会产生协同作用;

形态学观察K562细胞经KSS-KH处理后,细胞体积变大,呈现分化特征,提示KSS-KH可能会通过诱导K562细胞分化而发挥作用,但作用机制有待进一步研究;苦参酸-氨基甾体化合物(KSS-KH)是利用苦参碱为原料进行深度开发,充分利用我国独特的中药生态资源,发挥中医药在防治疑难病症中的作用。目前慢性髓性白血病(CML)主要采用化学药物和骨髓移植治疗,骨髓移植受供体来源等限制难以广泛使用,化学药物治疗中药物对人体正常细胞会产生较大的毒性,而本课题利用苦参碱合成的新型化合物,可发挥天然产物毒性较低的优势,使其更安全有效地用于临床,具有进一步研究开发的价值。

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