基于HPLC指纹图谱及多成分定量的白芍质量评价研究

刘珏玲，赵龙山

(1.山西省中医学校，山西 晋中 030619;2.沈阳药科大学药学院，辽宁 本溪 117004)

白芍来源于毛茛科植物芍药，干燥根是入药部位，具有养血调经，敛阴止汗，柔肝止痛，平抑肝阳等多种功效。《中国药典》(2020年版)中将芍药苷作为白芍质量控制的指标性成分[1]，但白芍成分多种，学者陆续从中分离出挥发油、黄酮、单贴及三萜类成分[2]。鉴于白芍成分多元，故仅使用芍药苷评价白芍药材及饮片的质量，无法全面考量药材的品质。而中药指纹图谱与含量测定相结合的评价方法可以从多角度评价和量化中药材及饮片，更能反映药材质量的真实性、优良性、稳定性[3,4]。

通过检索近几年的文献，关于白芍指纹图谱的研究很多，但是缺少一个能同时综合评价白芍药材和饮片质量的指纹图谱方法[1，3]。国内外研究表明，白芍总苷主要成分为芍药苷、芍药内酯苷[2]。因此，本实验将上述两种成分做为指标成分并建立含量测定方法，为白芍的质量控制及评价体系的建立提供依据。

1 仪器及试药

1.1 仪器

Agilent Technologies 1200 series；循环水真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亚荣)；旋转蒸发器(RE-52，上海亚荣)；数控超声波清洗器(KQ-250DB，昆山超声)。

1.2 试药及试剂

对照品芍药苷(Paeoniflorin，Pae)、儿茶素、苯甲酸(批号分别为110736-201842、110877-201604、00419-201703纯度≥97%)购自于中检院；芍药内酯苷(Albiflorin，Alb)、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯(批号为DST180419-071、DST180126-077、DST180226-063、纯度≥98%)购自于成都德思特；甲醇(分析级，康科德)；甲醇、乙腈(色谱级，康科德)；无水乙醇(分析级，恒兴试剂)；二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、磷酸(分析级，天津市富宇)；13批白芍药材(S01～S13)经山西卫生健康职业学院杨翠玲副教授鉴定为真品，13批白芍饮片(Y01～Y13)

2 方法与结果

2.1 溶液配制

2.1.1 对照品溶液的配制 指纹图谱对照品配制：称取Pae、Alb、苯甲酸、儿茶素、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯对照品各5 mg，置 5 mL容量瓶中，加 70% 乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的对照品溶液。含量测定对照品配制：取Pae、Alb对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含70 μg、160 μg的混合溶液。

2.1.2 供试品溶液配制 指纹图谱样品溶液：称取白芍药材或饮片的粉末约 0.2 g，置25 mL容量瓶中，加入 70% 乙醇溶解粉末，超声提取30 min；放冷后定容，摇匀药液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即可。

含量测定样品溶液：取药材粉末(Y01)约0.1 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加入 50% 甲醇，超声处理30 min，放冷，定容，摇匀，滤过，取续滤液，备用。

2.2 色谱条件

供指纹图谱使用：选用ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；柱温30℃；紫外吸收波长λ=270 nm；进样量10 μL；流动相(A)0.1%磷酸水和(B)乙腈；1.0 mL/min的流速。梯度洗脱程序如下：0～17 min，2%B，17～27 min，10%～15%B，27～29 min，15%～17%B，29～34 min，17%B，34～37 min，17%～20% B，37～57 min，20%～30% B，57～67 min，30%～45% B。

供含量测定使用：色谱柱：ZORBAX SB-C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：(A)0.1%磷酸水和(B)乙腈；λ=230 nm；进样量：10 μL；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min。流动相梯度洗脱程序如下：0～5 min，5%～16% B，5～10 min，16%～20% B，10～13 min，20%～30% B。

2.3 白芍指纹图谱方法学验证

2.3.1 精密度试验 根据2.1.2所述方法制备白芍指纹图谱溶液，精密吸取10 μL，连续进样6次，计算各共有峰tR 和相对峰面积(A) RSD 分别在0.045～1.23%及0.84%～4.50%，表明仪器状态良好，精密度结果可信度强。

2.3.2 重复性试验 精密称取S1 6份，按制备方法平行制得 6 份供试品溶液，进样测定，计算得到各共有峰的tR和相对A的 RSD 分别在0.04%～0.56%和1.05%～4.78%之间，表明该色谱方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 精密吸取同一份白芍药材指纹图谱供试品溶液，在0、2、4、6、8、12、24 h按照色谱条件分别进样10 μL，记录图谱并计算，结果为各共有峰的tR和相对A RSD分别在0.15%～1.07%，1.53%～4.95%之间，表明在0～24 h内白芍溶液是稳定的。

2.4 白芍药材饮片的指纹图谱建立

将13个批次白芍药材及饮片制备进样，所得的HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A)”，经平均数模式，全谱峰匹配处理，进行图谱拟合，生成叠加色谱图，图谱上共生成14个共有峰，见图1。同时采用对照品溶液加标法进行共有峰指认，标定，见图2。Pae峰形较好，分离度较好，色谱响应值较高，tR居中，因此选择Pae峰为参照峰，标记为S峰，见图2。

图1 13批白芍药材样品HPLC指纹图谱

图2 对照特征图谱注：峰3没食子酸；峰5没食子酸甲酯；峰7儿茶素；峰10芍药内酯苷；峰11芍药苷；峰121,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖

2.5 白芍药材饮片指纹图谱相似度评价

由表1可知，各个批次白芍药材/饮片的相似度在0.918～0.996。表明药材及饮片相似度较好，差异较小。

2.6 Pae和Alb苷含量测定方法学

2.6.1 专属性试验 取一批药材供试品溶液、50% 甲醇溶液、混合标准品溶液连续进样结果见图3，表明该方法专属性良好。

2.6.2 线性范围 称取2.5 mg Alb、5 mg Pae于25 mL容量瓶中，混匀，配制成Alb 100 μg/mL，Pae 300 μg/mL的混合标准品溶液。精密量取混标液(0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05 mL)，稀释定容，得Alb 5～80 μg/mL，Pae 15～240 μg/mL的标准溶液，进样，得到峰面积后计算与浓度的关系，建立标准曲线。

表1 白芍样品相似度

2.6.3 仪器精密度试验 将白芍供试品溶液24 h内依法连续进样6次，结果为Pae RSD值为1.31%、Alb RSD为1.27%。

2.6.4 日间精密度试验 将白芍按照之前所述方法制备，24 h内连续进样3次，持续3天，分别记录2种化合物的A，计算其RSD值，结果显示日内精密度RSD范围1.22%～1.93%，日间精密度RSD分别为1.80%和1.41%，符合要求。

表2 Pae、Alb线性关系、检测限和定量限结果

2.6.5 重复性试验 取同一批Y016份，分别制备样品溶液，连续进样，测定2种成分的峰面积，Pae和Alb峰面积RSD值分别为1.65%和1.64%。

2.6.6 稳定性试验 取同一批白芍药材粉末(Y01)，按上文方法制备，于0,2,4,6,8,12,24 h精密吸取10 μL，Alb和Pae RSD%值分别为0.42%和0.4%。表明溶液在24 h内稳定。

2.6.7 准确度试验 取已有含量数据的同一批白芍样品(n=3)，制备溶液后按照0.5∶1、1∶1、1.5∶1的比例添加2种成分对照品，进样分析测定，计算A，Pae和Alb的回收率，RSD在0.55～2.14之间，表明方法回收率良好。

2.7 13批白芍药材、饮片的含量分析

药材和饮片中2类指标成分的相差不大，说明经净制后，饮片中有效成分变化很小。见表4。

表3 Alb和Pae的稳定性结果

表4 26批白芍样品中芍药内酯苷和芍药苷的百分含量

3 讨论

3.1 色谱条件考察

在筛选色谱条件时，首先对考察紫外吸收波长，在270 nm时成分响应较好，故认定270 nm作为检测波长效果较好。而在230 nm处Pae和Alb的吸收均是最强的，因此含量测定的检测波长选择230 nm。

3.2 提取条件考察

考察了甲醇(70%、50%)、乙醇(70%、50%)四种不同的溶剂，实验表明50%甲醇效果最好，因此选择50%甲醇为提取溶剂。还分别考察了提取的溶液体积、时间，最后的条件是25 mL 50%甲醇提取15 min的效果最好。

4 结论

本研究系统的建立了白芍药材和饮片HPLC指纹图方法，通过对13批白芍药材和饮片的检测分析，共确认14个共有峰，26批次的指纹图谱数据的相似度为0.9，可较全面的反映白芍的化学成分信息，同时基于Pae和Alb的药效及药理作用，还完善了指标性成分的含量测定方法，2个方法相关的方法学验证符合要求。方法可以更为全面、系统地评价白芍的质量，为下一步白芍质量标志物筛选提供依据。