不同溶液浸泡后北柴胡种子中香豆素含量的测定

刘计权，王 宇，刘 昕，贺润丽

（山西中医药大学中药与食品工程学院，山西晋中030619）

中药柴胡来源于伞形科植物柴胡Bupleurum Chinese DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，按性状、产地的不同，前者习称为“北柴胡”，后者习称为“南柴胡”。柴胡具有解表和里、升阳、疏肝解郁、调经等作用，主治感冒、上呼吸道感染、疟疾、寒热往来、肋痛、肝炎、胆道感染、胆囊炎、月经不调等［1］。以柴胡为原料的中成药多达数十种，如复方柴胡注射液、热痛宁注射液、和解散、逍遥丸、逍遥合剂、肝得生丸等，新药发展迅速，导致柴胡的市场需求量猛增［2］。柴胡作为山西的优质道地药材和传统大宗药材，其产量约占全国产量的1/3 左右，山西从南到北各县几乎均有柴胡的生产基地。发展柴胡种植不仅能够满足我国中药产业健康发展的需求，而且有利于我省的经济结构转型，给药农带来可观的经济收益。

香豆素类化合物（coumarin）是一类具有苯骈α-吡喃酮母核的天然化合物，广泛分布于伞形科、芸香科等高等植物体内［3］。现代研究认为，柴胡种子富含香豆素类化合物，这些化合物会抑制柴胡种胚的发育和种子的发芽，造成柴胡在规范化栽培中种子萌发率低、出苗不整齐［4］。本文研究了不同溶液浸泡对北柴胡种子中香豆素类化合物的祛除效果，以期为柴胡生产上降低香豆素类化合物的抑制作用提供参考依据。

1 仪器与试药

UV6100S 紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；荧光微量石英比色皿（宜兴市晨伟玻璃仪器厂）；万分之一分析天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司）；HZC－250 恒温培养箱（苏州市培英实验设备有限公司）；循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

无水乙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）；香豆素对照品（大连美仑生物技术有限公司，批号S0515AS，纯度＞98%）；北柴胡种子购自山西省广灵县，经鉴定为伞形科柴胡Bupleurum chinensis DC.的种子。

2 方法与结果

2.1 北柴胡种子的处理

在室温20 ℃条件下，准确称取20 g 北柴胡种子共5 份，分别加入200 mL 蒸馏水、甲醇、乙醇、丙酮和乙醚溶液，浸泡12 h、24 h 后各取出10 g 种子，50 ℃烘干用于供试品溶液制备。试验重复3 次。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取香豆素对照品8.02 mg，置100 mL量瓶中，加无水乙醇超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.080 2 mg/mL 对照品溶液。

2.3 提取工艺优化与供试品溶液的制备

将未经处理的北柴胡种子研磨成粗粉，用电子天平称取1 g，精密称定，加入无水乙醇浸泡24 h后回流提取。采用L9（34）表进行正交试验，以乙醇用量、提取时间和提取次数为因素进行提取工艺优化，提取条件因素水平表见表1，提取工艺的正交试验结果见表2。

表1 因素水平表

对表2 数值进行直观分析可以看出，各因素对总香豆素得率影响作用由大到小依次为提取次数＞乙醇用量＞提取时间，初步确定最优的工艺参数为A3B1C3，即乙醇用量100 mL、提取3 次、每次1 h。为进一步明确各因素水平变化对试验结果是否具有显著影响，进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析结果显示，提取次数对实验结果产生显著性影响，乙醇用量和提取时间对试验结果无显著性影响。从经济节约的角度考虑，确定最优提取工艺为A1B1C3，即提取3 次，每次加入无水乙醇60 mL，每次提取1 h。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析结果

按优化提取工艺进行回流提取，合并3 次滤液，无水乙醇定容至200 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 测定波长的选择

取对照品溶液、样品溶液分别在波长200～400 nm 进行光谱扫描，结果均在322 nm 处有最大吸收，光谱图形亦基本相同，故选择测定波长为322 nm。

2.5 标准曲线的制备

精密吸取香豆素对照品溶液0.5、1、2、3、5、7 mL，置25 mL 量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，以乙醇为空白，于322 nm 处测定吸光度。以对照品的质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，进行线性回归分析得回归方程y=0.0267x－0.0057，r=0.9991，结果表明香豆素对照品在1.60～22.46 μg/mL 之间与吸光度有良好的线性关系。

2.6 精密度试验

精密吸取对照品溶液2 mL，置25 mL 量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，对照品溶液连续测定6 次，测得吸光度的平均值为0.171，RSD 为0.753%。结果表明该方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别于0、0.5、1、1.5、2、4、8、10 h 测定吸光度，结果RSD=1.90%，表明样品溶液在10 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取未经处理的北柴胡种子粗粉6 份，每份1 g，按2.3 方法分别制备供试品溶液，测定吸光度，计算得到北柴胡种子中香豆素的平均含量为0.593%，RSD 为1.87%，结果表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取北柴胡种子粗粉约0.5 g，平行操作6 份，置圆底烧瓶中，各精密加入香豆素对照品溶液（1 mg/mL）3 mL，依据2.3 方法制备供试品溶液，在322 nm 下测定吸光度，计算回收率。测定结果表明，平均回收率为98.71%，RSD 为1.30%，该法加样回收率良好。结果见表4。

表4 加样回收率试验 （n=6）

2.10 不同处理方法种子中香豆素含量的测定

取不同2.1 中方法处理的北柴胡种子粗粉，按照2.3 方法制备供试品溶液并测定香豆素的含量，测定结果见表5。

表5 不同处理后北柴胡种子中香豆素的含量 （n=3）

由表5 可知，未经处理的柴胡种子中香豆素的含量最高，经不同溶剂浸泡后，柴胡种子中香豆素的含量均呈现不同程度的下降，且浸泡时间越长柴胡种子中香豆素的含量越低。其中以乙醚溶液浸泡后柴胡种子中香豆素的含量最低，乙醚溶液对柴胡种子中香豆素的溶出效果最好。

3 讨 论

北柴胡种胚的发育先后要经过原胚、棒状胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和双子叶胚等几个阶段［5］。自然成熟期采收的北柴胡种子的胚处于不同发育阶段，经石蜡切片研究发现，约20%左右的种胚处于球形胚，70%左右的种胚处于心形胚，10%左右的种胚发育到鱼雷胚，没有发现处于双子叶胚阶段的种胚［6］。自然成熟期的柴胡种胚存在形态后续现象，所以即使给予适宜的发芽条件也不可能萌发。

伞形科植物中含有香豆素类、皂苷类、黄酮类、挥发油类等多种化学成分［7］，柴胡种子中的香豆素类、皂苷类化合物对柴胡种胚发育具有抑制作用，其中香豆素类化合物是种胚发育的主要抑制物质，正是这类化学成分对柴胡种胚发育产生明显的抑制作用，阻碍柴胡种胚的生长和分化，导致柴胡种胚的形态后熟现象［8］。

柴胡种胚存在形态后续现象，造成生产上发芽率低、出苗不整齐，进而影响到柴胡的产量和质量，这是制约柴胡生产的重要因素。本文在不破坏北柴胡种子结构的前提下，研究了不同溶液对北柴胡种子中香豆素的溶出效果，以期通过降低种子中香豆素类化学成分的含量减轻其对北柴胡种胚发育的抑制作用，加速北柴胡种胚的发育成熟，提高种子的发芽率和出苗整齐度。关于不同溶液浸泡后对北柴胡种子的安全性、对北柴胡种胚发育和种子发芽率的促进作用有待于进一步研究，后续相关实验正在进行中。