益肾降浊冲剂对5/6 肾切除模型大鼠肾纤维化及NF－κB 和TGF－β1/Smad3 信号通路的影响

郑敏麟，伞 勤，刘 广

（1.福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122； 2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一种常见的进行性疾病，同时也是世界上死亡率和发病率最高的疾病之一［1］。其中肾脏纤维化是CKD 的主要病理改变［2］，同时也是造成CKD 患者死亡的重要原因之一［3］。慢性肾脏病能够活化间质成纤维细胞，使其转化为α－平滑肌肌动蛋白（alpha－smooth muscle actin，α－SMA）阳性的肌成纤维细胞，这些间质的肌成纤维细胞的积累和细胞外基质的沉积会引起肾间质纤维化［4－6］。而上述肾间质成纤维细胞的活化过程，被认为是由生长因子和炎性细胞因子逐渐增加所介导的［7］。现已有许多研究证实了核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）在介导炎症反应中发挥着其重要的作用，而除了NF-κB 之外，转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）也被认为在炎症反应中发挥着其独特的作用，TGF-β1可能通过Smad 信号通路发挥其作用。一些细胞因子通过激活TGF-β1/Smad3 信号通路，刺激胶原蛋白基质沉积并促进肾小管间质和肾小球纤维化［8-9］。前期研究已经证实，益肾降浊冲剂能够改善5/6 肾切除大鼠的肾脏功能，延缓慢性肾衰的进展，且有研究表明，其机制可能与抑制TGF-β1与Smad3信号通路相关［10-11］。在前期研究的基础上，本研究拟从NF-κB 与TGF-β1/Smad3 双信号通路角度进一步探讨益肾降浊冲剂在慢性肾脏病中的抗纤维化作用，为慢性肾脏病的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠72 只，雌雄各半，6 周龄，重量（180～220）g，购自上海史莱克实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，合格证编号：20170005005915。饲养于福建中医药大学实验动物中心，温度（22±2）℃，相对湿度（55±2）%，自由摄食饮水。

1.1.2 药物与试剂 益肾降浊冲剂由生黄芪30 g，太子参15 g，白术15 g，茯苓15 g，玉竹15 g，当归15 g，桑椹15 g，桑寄生15 g，怀牛膝15 g，丹参15 g，山楂15 g，陈皮15 g，大黄15 g，六月雪15 g，车前子15 g 组成，由福建省第三人民医院中药房提供。大黄素（索莱宝科技有限公司，批号：IE0070）。肌酐测定试剂盒、尿素氮测定试剂盒（长春汇力，批号分别为：A015、B006），Masson 三色染色试剂盒（索莱宝科技有限公司，批号：G1340），白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒（上海西唐，批号分别为：F15810、F15871、F16960），NF-κB、TGF-β1、Smad3 抗体（Abcam 公司，批号分别为：ab16502，ab215715，ab40854），免疫组化试剂盒（凯基生物，批号：KGOS60）。

1.1.3 实验仪器 台式离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：Anke，TDL80-2B），酶标仪（美国特宝，型号：Epoch），石蜡切片机（德国莱卡，型号：RM2235），生物组织摊烤片机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司，型号：YT-7FB），倒置显微镜（日本尼康，型号：TS-100F）。

1.2 实验方法

1.2.1 尿毒症大鼠模型的建立 手术大鼠以20%乌拉坦麻醉，先切除左肾2/3 肾组织，后于1 周后切除整个右肾，两次手术共切除肾脏约80%左右。假手术大鼠仅在背部做一切口，暴露肾脏后再缝合伤口。

1.2.2 分组及给药 72 只大鼠随机选取12 只进行假手术，其余为60 只进行手术，按以上方法制作尿毒症大鼠模型。手术完成后，剔除手术失败和死亡的大鼠，造模成功存活50 只大鼠，将造模成功的大鼠随机分为模型组，大黄素组，益肾降浊冲剂低、中、高剂量组，另从12 只假手术大鼠中随机选出10 只作为假手术组，然后根据大鼠剂量是人体6 倍的计算公式，计算出益肾降浊冲剂按照低、中、高剂量（9 g/kg，18 g/kg，36 g/kg）配成水煎剂，大黄素的剂量为500 mg/kg，药液按1 mL/100 g灌胃量进行灌胃，模型组和假手术组予等体积蒸馏水灌胃，连续用药8 周。

13 标本收集与检测方法

治疗结束后进行取材，取材前1 晚给予禁食处理，第2 天以20%乌拉坦经腹腔注射麻醉，麻醉完成后，取腹主动脉血用于ELISA 及生化检测。取血完成后取肾脏，取出肾脏后，用生理盐水冲洗除去血污及脂肪等组织，放入4%多聚甲醛中用于石蜡包埋。

1.3.1 各组大鼠血清BUN、SCR 含量检测 将取出的腹主动脉血室温静置2 h 以后，将腹主动脉血离心，得到血清，按照试剂盒说明书进行检测。

1.3.2 各组大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量测定 分别采用大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒检测外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，并参照该试剂盒说明书操作。

1.3.3 肾脏组织Masson 染色 取石蜡块，切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，Weigert 铁苏木素染色液染色5 min，酸性乙醇分化液分化10 s，Masson 蓝化液返蓝10 min，蒸馏水洗1 min，丽春红品红染色液染色3 min，磷钼酸溶液洗2 min，弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺蓝染色液中染色50 s，弱酸工作液洗1 min，酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，后观察各组大鼠肾脏纤维化情况。

1.3.4 肾脏组织中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白检测 取肾脏组织，石蜡包埋，包埋后切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，脱水后，枸盐酸微波修复20 min，恢复至室温之后，滴加过氧化氢室温孵育15 min，PBS 清洗3 次后，滴加5%羊血清，室温孵育60 min，然后滴加一抗，4 ℃孵育过夜，第2 天将切片从冰箱中拿出，恢复至室温后，PBS 清洗3 次，滴加2抗，孵育30 min 后，PBS 清洗3 次，随后DAB 显色，显色后，苏木素复染细胞核，中性树脂封片。每组切片选取6 个视野，再采用Image-Pro Plus 6.0分析NF-κB、TGF-β1、Smad3 的表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件包进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组数据分析采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中BUN、SCR 含量比较

与假手术组比较，模型组血清水平BUN、SCR明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，大黄素组，益肾降浊冲剂高、中、低剂量组大鼠血清BUN、SCR明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、SCR 含量比较 （±s）

表1 各组大鼠血清BUN、SCR 含量比较 （±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

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2.2 各组大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比较

与假手术组比较，模型组血清水平IL-1β、IL-6、TNF-α 明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，大黄素组，益肾降浊冲剂高、中、低剂量组大鼠血清IL-1β 明显降低（P＜0.05，P＜0.01），益肾降浊冲剂高剂量组IL-6、TNF-α 含量明显降低。结果见表2。

2.3 各组大鼠肾脏组织Masson 染色比较

Masson 染色结果显示，假手术组大鼠肾组织只发现少量胶原纤维沉积。模型组大鼠的胶原纤维沉积明显。益肾降浊冲剂各剂量组胶原沉积情况明显改善。结果见图1。

表2 各组大鼠外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α 含量的比较（x ±）s

图1 各组大鼠肾脏组织Masson 染色（400×）

2.4 各组大鼠肾脏组织NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表达情况

与假手术组比较，模型组大鼠肾脏组织中NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.01）；与模型组比较，益肾降浊冲剂中、高剂量组大鼠肾脏组织中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），益肾降浊冲剂低剂量组NF-κB 表达降低（P＜0.05），大黄素组TGF-β1 和Smad3 表达降低（P＜0.05）。结果见表3，图2～4。

表3 各组大鼠肾脏组织NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表达情况 （x ±）s

图2 各组大鼠肾脏组织中NF-κB 蛋白表达情况（400×）

3 讨 论

肾纤维化在慢性肾脏病患者一种常见的病理改变，同时也是CKD 发展终末期肾功能衰竭的主要原因之一。肾纤维化主要病理特征是细胞外基质（ECM）蛋白过度积聚、基底膜增厚，最终导致肾功能损伤，最终引起慢性肾衰竭［11］。

众所周知，炎症反应在慢性肾脏病肾病纤维化发展过程中发挥着重要作用［13］，而NF-κB 信号通路被认为是介导肾脏纤维化发展过程中肾脏炎症的一条重要途径［14］。当NF-κB 信号通路被激活时，会释放一系列的促炎症因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α 等，这些炎症细胞因子通过刺激肾脏从而诱导肾小管上皮细胞表型转变为间充质细胞进而促使大量ECM 蛋白沉积在肾间质，从而促进肾纤维化形成［15］。孙响波等［16］研究表明，通过抑制NF-κB 信号通路能够有效地抑制炎症反应，进而达到抑制肾纤维化的目的。

图3 各组大鼠肾脏组织中TGF-β1 蛋白表达情况（400×）

图4 各组大鼠肾脏组织中Smad3 蛋白表达情况（400×）

近年来研究表明，除了NF-κB 信号通路外，TGF-β1也是造成慢性肾脏病肾纤维化的一条重要通路，TGF-β1能够通过结合I 型和II 型TGF-β受体复合物刺激成纤维细胞的增殖和基质积累，进而激活TβRI 激酶，导致Smad2 和Smad3 磷酸化和激活。一旦被激活，Smad2 和Smad3 通过与Smad4 形成寡聚复合物而转运到细胞核中［17］，从而诱导ECM 产生最终造成肾纤维化。陶鹏宇等［18］研究表明，当TGF-β1/Samd3 信号通路被抑制时，肾脏纤维化情况能够得到明显改善。

中医药在我国有着广泛用于慢性肾脏病治疗的历史，并被公认为现代医学的有效补充。在中医文献中并无关于肾脏纤维化的记载，但根据肾纤维化的形成和发展过程，可将其归为中医学中的“癥积”“水肿”“关格”等范畴。脾肾亏虚日久，导致湿毒外邪入侵，造成肾脉络瘀阻，湿毒瘀在体内相互交结，最终对肾脏造成损伤。而益肾降浊冲剂出自福建省名中医阮诗玮，具有健脾益气、利湿泄浊化瘀的功效，对改善肾纤维化具有明显辅助效果。本研究以5/6 肾切除诱导的慢性肾脏病大鼠模型为研究对象，观察益肾降浊冲剂对慢性肾脏病大鼠肾纤维化的治疗效果，结果显示益肾降浊冲剂能够延缓肾脏纤维化，降低血液中Scr、BUN，表明益肾降浊冲剂具有显著的肾保护作用。

本研究结果显示，模型组大鼠血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表达明显上升，而益肾降浊冲剂各剂量组大鼠血清中IL-1β 表达明显下降，益肾降浊冲剂高剂量组IL-6、TNF-α 表达明显下降，提示益肾降浊冲剂能够降低炎症相关细胞因子表达，在此基础上利用免疫组化法进一步对各组大鼠的肾脏中NF-κB、TGF-β1、Smad3蛋白进行检测，结果显示模型组肾脏组织中NFκB、TGF-β1、Smad3 蛋白表达升高，而益肾降浊冲剂中、高剂量组NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白表达下降，表明益肾降浊冲剂能够抑制炎症相关细胞因子表达，减轻肾脏纤维化程度，改善肾功能，这可能与抑制NF-κB、TGF-β1、Smad3 蛋白相关。

综上所述，益肾降浊冲剂可抑制慢性肾脏病的肾纤维化、减轻机体炎症损伤，其机制可能与抑制NF-κB、TGF-β1、Smad 信号通路有关。