血府逐瘀汤对抑郁模型小鼠行为学及脑内单胺类神经递质的影响

王永杰，刘广超，王慧娟，许雪春，张丽娜，李二贤，赵凤玲

（1.河南省职业病防治研究院，河南省第三人民医院，河南 郑州450052； 2.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州450000）

抑郁症是以情绪低落为主要特征的一类心理疾病，主要表现为持久情绪低落、思维迟缓、精力下降、食欲不振、性欲减退、睡眠障碍等［1］。随着人们生活压力的增加，抑郁症的发病率越来越高，已成为威胁人类健康的重大问题［2-4］。该病属多因素疾病，病因复杂，发病机制涉及生理、心理、社会等多方面，尚未完全明确［5］。临床上常以药物、心理、物理等方法综合治疗，虽有一定的缓解作用，但不良反应多，依从性差，易复发。因此，寻找有效的治疗方法显得尤为重要。

中医学关于情志病的治疗历史悠久，最早见于《山海经》，该书记载了38 种疾病，其中就有“狂”“痴”等记载。此后，在《吕氏春秋》《楚辞》《左传》《史记》等文献中亦有情志致病的记载。情志医学提出于《黄帝内经》，其明确病证名称，认识病因病机，并注意到躁狂、抑郁、双向障碍，如《灵枢·癫狂》载“狂始生，先自悲也”；还提出了移精祝由法、情志相胜法、语言开导法等治法。后世医家在《黄帝内经》认识的基础上，对抑郁症有更加深入的研究。抑郁症属于“郁症”“百合病”“脏躁”等范畴［6-8］，以情志所伤、气机郁滞为主要病因，病机主要是由于气机紊乱、五脏气血失调，治疗以疏肝理气、活血化瘀等为主。因此，本研究选用血府逐瘀汤进行研究，该方出自王清任的《医林改错》，方由桃红四物汤合四逆散加桔梗、牛膝而成，具有疏肝理气、活血化瘀之功效，契合抑郁症之病机。本实验以昆明种小鼠为对象，探讨血府逐瘀汤对抑郁小鼠行为学及脑内单胺类神经递质的影响，为血府逐瘀汤在抑郁症临床治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 本研究选用40 只雄性4～6 周龄SPF 昆明种小鼠，体质量（20±4）g，购自河南省实验动物中心，合格证号：SCXK（豫）2015-0004，饲养于河南中医药大学动物实验中心，饲养于温度15～26 ℃、相对湿度40%～70%的环境中，并采用自由采食、饮水。

1.1.2 实验仪器 高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：HC-2064）；小鼠自主活动测试仪（成都泰盟科技有限公司，型号：ZZ-6）；电子恒温水浴锅（余姚布亚星仪器仪表有限公司，型号：DZKW-C）；涡旋混匀器（江苏康健医疗用品有限公司，型号：XH-D）；酶标仪（上海塞默飞世尔仪器有限公司，型号：MULTISKAN FC）；电子秤（上海精天电子仪器有限公司，型号：JT601N）；电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司，型号：BSA224S）。

1.1.3 药品与试剂 盐酸氟西汀胶囊（常州四药制药公司，批号：国药准字H19980139）；5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：fk1983Y）；去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H096）；多巴胺（dopamine，DA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：H170）；血府逐瘀汤组方药材（桃仁、红花、当归、生地黄、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡、枳壳、甘草）均购自河南中医药大学第一附属医院，并经3名中药师鉴定。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 所有40 只大鼠适应性喂养14 d后，随机分为正常对照组、模型组、血府逐瘀汤组和盐酸氟西汀组，共4 组。

1.2.2 药物制备 制备血府逐瘀汤煎剂，药物由桃仁12 g，红花9 g，当归9 g，生地黄9 g，川芎4.5 g，赤芍6 g，牛膝9 g，桔梗4.5 g，柴胡3 g，枳壳6 g，甘草6 g 组成。本研究所有药物均购自河南中医药大学第一附属医院，且经3 名中药师鉴定。所有药物清洗后，浸泡1 h 后，入锅，武火烧开后，文火煎40 min，去渣，浓缩成每毫升含1 g 生药的溶液备用。

1.2.3 造模与给药 40 只小鼠除正常对照组外，其余30 只小鼠每天选取3～4 个应激因子进行慢性不可预知性刺激（CUMS）。本研究选用的应激因子主要是12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °倾斜饲养、夹尾（距尾根1 cm 处夹闭1 min）、光照等，持续3 周，从而建立抑郁症小鼠模型［9］。中药给药剂量根据人鼠换算公式S小鼠/20g=0.0026×S人/70kg，得血府逐瘀汤给药剂量（口服剂量）为每只小鼠0.2028 g/20 g（成人120 g/70 kg），即每只小鼠10.14 g/kg。血府逐瘀汤组小鼠按10.14 g/kg（含生药1 g/mL）剂量灌胃血府逐瘀汤，每日2 次，连续14 d。盐酸氟西汀组小鼠按10 mg/kg 剂量（0.1%的盐酸氟西汀给药体积为10.14 mL/kg）灌胃盐酸氟西汀，每日2 次，连续14 d。按照等量不等浓度的原则，正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水，每日2 次，连续14 d。

1.3 行为学观察

1.3.1 自主活动次数测定 为使实验小鼠熟悉环境，先将各组小鼠放入自主活动仪10 min，待小鼠适应环境后开始正式实验。正式实验是将各组小鼠依次放入自主活动仪内10 min，在5 min 后，开始记录各组小鼠的水平活动次数、垂直活动次数。

1.3.2 悬尾实验 各组小鼠给药结束1 h 后，将小鼠尾端2 cm 的部位贴在一根水平木棍上，使小鼠成倒挂状态，其头部离台面约5 cm，用板隔开相邻动物的视线。比较各组小鼠在6 min 内累计不动的时间。

1.3.3 强迫游泳实验 各组小鼠在给药结束4 d后进行强迫游泳实验。本研究是将各组小鼠置于水温25 ℃，水深30 cm 的玻璃烧杯中6 min，观察6 min 内各组小鼠累计不动时间。不动时间的判定标准：小鼠在烧杯内漂浮在水面，不努力爬出烧杯，仅做一些必须保持其头部在水面的动作［6］。

1.3.4 大脑海马区神经递质含量测定 将各组小鼠颈椎脱臼处死，在冰台上分离大脑海马组织，匀浆，3000 r/min 离心20 min，取上清，保存于-20 ℃以下的冰箱。测定各组小鼠脑组织中5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠自主活动次数测定结果

与正常对照组比较，模型组小鼠水平运动次数、垂直运动次数均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，血府逐瘀汤组和盐酸氟西汀组小鼠水平运动次数、垂直运动次数均显著升高（P＜0.01，P＜0.05），差异有统计学意义。结果见表1。

表1 各组小鼠自主活动次数比较 ±s（次， ）

表1 各组小鼠自主活动次数比较 ±s（次， ）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01

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2.2 各组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间比较

与正常对照组比较，模型组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间显著增加（P＜0.01），差异有统计学意义；与模型组比较，血府逐瘀汤组和盐酸氟西汀组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间显著降低（P＜0.01），差异有统计学意义。结果见表2。

表2 各组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间比较 ±s

表2 各组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间比较 ±s

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01

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2.3 各组小鼠小鼠海马组织神经递质含量测定结果

与正常对照组比较，模型组小鼠5-HT、NE、DA 含量显著降低（P＜0.05），差异有统计学意义；与模型组比较，血府逐瘀汤组和盐酸氟西汀组小鼠5-HT、NE、DA 含量升高（P＜0.05），差异有统计学意义。结果见表3。

表3 各组小鼠海马组织神经递质含量比较 ±s（ng/mL， ）

表3 各组小鼠海马组织神经递质含量比较 ±s（ng/mL， ）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05

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3 讨 论

抑郁症是一种发病率较高的精神疾病［7］，多由情志改变引起，气机阻滞为其核心病机，主要表现为心情抑郁、情绪不宁、易怒善哭等，而引起抑郁症的主要因素是应激刺激［10］。本研究采用12 h 禁食、12 h 禁水、12 h 45 °倾斜饲养、夹尾等多种低强度刺激的方法制备抑郁症小鼠模型。该造模方法与人类抑郁症的生物学机制接近，如悬尾和强迫游泳实验是对抑郁症患者快感缺乏、兴趣缺失、精神运动迟滞等抑郁症状进行模拟［11-14］。因此，该方法制备抑郁症模型，能解释抑郁症的显著异质性，可用于本实验研究。

目前文献研究发现，血府逐瘀汤已用于抑郁症的临床治疗，但实验室研究较少，其作用机制尚不清楚。本研究结果表明，血府逐瘀汤能明显增加抑郁小鼠的自主活动次数，并能明显减少悬尾和强迫游泳不动时间，初步证明该药有抗抑郁作用。

目前，抑郁症发病机制的研究较多，如单胺类神经递质假说、受体假说、脑源性神经营养因子假说等，其中脑内单胺类神经递质假说得到业内认可［15-17］。该学说认为，抑郁症主要是由于单胺类神经递质NE、5-HT、DA 分泌不足所致。因此，抑郁症治疗多以NE、5-HT、DA 为靶点［18-20］，通过增加脑内突触间隙单胺类神经递质含量，增强其生理功能来起到抗抑郁的作用。本实验采用ELISA 法测定了抑郁小鼠脑内海马组织中NE、5-HT、DA水平，结果表明，血府逐瘀汤能明显升高抑郁小鼠脑内海马组织中NE、5-HT、DA 水平，其抗抑郁作用机制与提高小鼠脑内单胺类神经递质水平相关。

综上所述，本实验通过观察抑郁小鼠自主活动次数、悬尾与强迫游泳不动时间等指标认为血府逐瘀汤具有抗抑郁作用，通过进一步测定小鼠海马体内单胺类神经递质（NE、5-HT、DA）水平变化，揭示血府逐瘀汤抗抑郁的作用机制，为临床应用提供依据。