地龙提取物冻干口崩片的制备工艺研究

吴茜，李红鑫，李聘，吴婧楠，孙常胜，薛婉莹，郭杏梅，孙腾跃，蔡程科*，王洪飞*（.北京中医药大学中药学院，北京 0488；.北京量子高科制药科技有限公司，北京 000）

《中国药典》2020年版收载地龙来源于钜蚓科动物参环毛蚓、通俗环毛蚓、威廉环毛蚓或栉盲环毛蚓的干燥体，前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”[1]。其用于治疗高热神昏，惊痫抽搐，肢体麻木，半身不遂等。现代研究证明地龙主要的化学成分有蛋白质、多肽、氨基酸、脂肪酸等[2-4]。地龙提取物中含有纤溶活性物质[5]，可有效溶解血栓，并把这种活性物质命名为蚓激酶。研究发现地龙活性提取物经灌胃给药可减轻大鼠血小板黏附率[6]，提高小鼠红细胞变形性[7]。采用鲜地龙煎汤口服配合温针灸治疗半身不遂，具有显著效果[8]；临床运用复方地龙胶囊口服可有效治疗缺血性中风恢复期[9-10]。地龙品种繁多，来源广泛，市售蚓激酶制剂来源于人工养殖赤子爱胜蚓，地龙提取物具有很强的纤溶活性（大于20 000 U·mg－1），分子量主要分布在15 ～60 kDa。地龙提取物应用广泛，上市剂型均为口服片剂或者胶囊剂，特殊患者服药困难，临床应用受到限制。口腔崩解片（简称口崩片）可在水中迅速崩解，对口腔黏膜无刺激，容易吞咽[11-12]，为特殊患者如老人、小孩、具有精神疾患的人群开辟了用药新途径。冷冻干燥法干燥温度低，能够保存物料中的活性物质不发生改变，可在口腔中迅速崩解，在食品和药品领域应用广泛[13-15]。运用冻干技术制备的口崩片无需用水送服，可用于吞咽障碍以及昏迷人群，极大地提高了服药顺应性。因此本研究采用冷冻干燥法制备地龙口崩片，对处方组成和冻干工艺进行探索。

1 材料

1.1 试药

地龙提取物（批号：20191011，哈尔滨九信医药科技有限公司，规格：500 g/袋，蛋白含量大于90%）；普鲁兰多糖（批号：7E1412，日本林原株式会社）；甘露醇（批号：1907016，河北华旭药业有限公司）；蔗糖（批号：B10090850，麦克林）；三氯蔗糖（批号：Z115011708，山东中怡三氯蔗糖制造有限公司）；柠檬香精[批号：W-FL120053，威尔芬（北京）科技发展有限公司]。

1.2 仪器

高剪切混合乳化机（BME100LX，上海威宇机电制造有限公司）；真空冷冻干燥机（GLZ-0.4 m3，北京速原真空技术有限公司）；共晶点测试仪[RS232，奥特佳美（北京）科技有限公司]。

2 方法与结果

2.1 地龙提取物冻干口崩片的制备方法

按照处方称取物料置于剪切杯中，水定量至40 g，搅拌均匀，2500 r·min－1剪切5 min，转移至脱气瓶内，磁力搅拌下真空脱气至无气泡。取药液分装于泡罩中，0.4 mL/片，置于－60 ℃冰箱内预冻30 min，按照设定的曲线进行冻干，压力升高试验合格后，出箱。从冻干机中取出泡罩板，用铝塑袋热封包装。

2.2 地龙提取物冻干口崩片的质量评价标准

将冻干口崩片的质量分为1 ～5 级，分别计1、2、3、4、5 分，等级越高，质量越好。外观评分取多个评价指标的加和总分。

2.2.1 外观考察

① 颜色：取出片剂，在光线明亮的地方进行观察，描述口崩片的颜色，分为五个等级。片剂颜色均匀，色泽一致为等级5；有晕圈，分界不规则，片面一种颜色占片剂表面积的70%～90%为等级4；有晕圈，分界明显、规则，片面一种颜色占片剂表面积的60%～70%为等级3；有晕圈，分界不规则，片面一种颜色占片剂表面积的50%～60%为等级2；有色泽差异，晕圈不规则为等级1。

② 光洁度：取出片剂，在光线明亮的地方进行观察，描述口崩片的光洁程度，分为五个等级。表面平整光滑为等级5；表面有麻点、裂纹，面积占比小于10%为等级4；表面看到明显细小裂纹，占比10%～30%为等级3；表面明显看到深度裂纹、表面粗糙，占比30%～60%为等级2；表面严重裂纹，占比大于60%为等级1。

③ 裂边：取出片剂，在光线明亮的地方进行观察，描述口崩片表面与边缘的形态，分为五个等级。边缘无裂纹为等级5；裂边面积占比小于5%为等级4；裂边面积占比5%～15%为等级3；裂边面积占比15%～30%为等级2；裂边面积占比大于30%为等级1。

④ 融片：取出片剂，将片剂倒置、掰开，在光线明亮的地方进行观察，描述片剂底部以及断面的情况，初步判断有无融片。由于地龙本身颜色较深，当出现融片时颜色呈棕褐色，与周围的颜色形成色差。根据底部以及周边的颜色判断有无融片，分为五个等级。底部及周边无融化塌陷，颜色均一无色差为等级5；有色差，占比小于20%为等级4；有色差，占比20%～30%为等级3；有色差，占比30%～40%为等级2；融化塌陷严重，有色差，占比大于40%为等级1。

⑤ 饱满度：取出片剂，在光线明亮的地方进行观察，描述口崩片的外形，分为五个等级。片子中心鼓起，从中心到边缘逐步降低，片子全部覆盖铝窝为等级5；片子比较平坦，中心略高于边缘或与边缘平齐，片面中间无凹陷，片子全部覆盖铝窝为等级4；片中心比边缘高，片面凹陷，片子全部覆盖铝窝为等级3；片中心比边缘低，片子全部覆盖铝窝为等级2；片型凹凸不平为等级1。

⑥ 完整性：取出片剂，在光线明亮的地方进行观察，描述片剂与铝窝粘连后的片剂完整情况，分为五个等级。黏壁总面积（底部＋侧面）小于10%为等级5；黏壁总面积为10%～20%为等级4；黏壁总面积在20%～30%为等级3；黏壁总面积在30%～60%为等级2；黏壁总面积大于60%为等级1。

2.2.2 口尝感受

① 口感：取出片剂，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，评价口崩片在口腔中的感受。五人同时口尝后进行等级评价，取平均分数而得。入口即化（时间小于10 s），无沙砾感为等级5；入口崩解较缓（时间10 ～30 s），有沙砾感为等级4；入口崩解缓慢（大于30 s），有沙砾感为等级3；入口崩解缓慢，成团，有沙砾感为等级2；入口成团，有沙砾感为等级1。

② 口味：取出片剂，置于舌中部，不咀嚼，不用水送服，直至完全崩解，评价口崩片在口腔中的味道感受。五人同时口尝后进行等级评价，取平均分数而得。无异味、无苦、无麻舌、无刺激感，口味适中为等级5；有异味、苦、麻舌、刺激感任意1 ～2 项为等级4；有异味、苦、麻舌、刺激感任意3 项者为等级3；有异味、苦、麻舌、刺激者为等级2；异味、苦、麻舌、刺激严重者为等级1。

2.2.3 崩解 检测口崩片的崩解时间。取片剂6片，分别置于40 mL、（37±2）℃蒸馏水的培养皿中，在入水时开始用秒表计时，直到片剂完全崩解，记录崩解时间，分为五个等级。崩解时间小于10 s 为等级5；崩解时间10 ～15 s 为等级4；崩解时间15 ～20 s 为等级3；崩解时间大于20 s为等级4；崩解时间大于30 s 为等级1。

2.2.4 微观结构 评价口崩片的孔道排列状况。取片剂，对其纵切面进行电镜扫描，观察其微观结构。

2.2.5 生物效价 精密称取地龙提取物22.7 mg、口崩片粉末66.3 mg 于25 mL 量瓶中，加0.9%NaCl 超声溶解，定容至刻度，备用。纤维蛋白平板法测定其生物效价[16]，聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白条带[17]。评价制剂工艺对生物效价和蛋白种类的影响。

2.3 处方筛选

预试验选择甘露醇作为骨架支撑剂、普鲁兰多糖作为黏合剂，蔗糖、三氯蔗糖和柠檬香精作为调味剂。固定甘露醇-普鲁兰多糖的质量比为1∶1。选择主药地龙提取物含量30 mg/片进行处方考察，筛选最佳处方。

2.3.1 甘露醇-普鲁兰多糖用量考察 固定浓度蔗糖2%、三氯蔗糖0.01%、柠檬香精1%，考察1∶1 比例下甘露醇和普鲁兰多糖的浓度对口崩片外观性状（颜色、光洁度、裂边、融片、饱满度、完整性）和崩解时间的影响。考察结果表明当两者浓度小于4%时，口崩片颜色不均，塌陷、融片严重，普鲁兰多糖、甘露醇的浓度应分别保持在4%及以上的水平以维持片剂的基本骨架形态。随着两者用量增加，在口腔中崩解变缓，但可均匀分散，无沙砾感，结果见表1。

2.3.2 蔗糖用量的考察 固定蔗糖、普鲁兰多糖、甘露醇总浓度12%，考察蔗糖浓度对口崩片外观和崩解时间的影响。设定蔗糖的浓度为2%、4%、6% 3 个浓度等级进行考察，考察结果如表2。当基质总含量保持在12%时，在口腔中崩解无差异，随着蔗糖浓度的增加，口崩片的外观形态变差。

2.3.3 口味考察 地龙属于虫类中药，蛋白含量丰富，其腥臭味导致患者服药依从性低。根据预试验选取蔗糖、三氯蔗糖、柠檬香精的组合对口味进行改善，结果见表3。蔗糖浓度的变化对于甜度的改善不明显，超过4%片形变差，但可缓解三氯蔗糖的甜味带来的味觉不适。三氯蔗糖的量在0.03%～0.05%均可接受，而当柠檬香精的量小于3%时，口崩片的腥味仍然较重。

表1 甘露醇-普鲁兰多糖用量考察Tab 1 Pullulan and mannitol dosage

表2 蔗糖用量的考察Tab 2 Sucrose dosage

表3 口味考察Tab 3 Taste investigation

2.3.4 正交试验优化处方 以片剂外观、口味、崩解时间等为指标进行评分。总分为45 分，取综合评分最高者为最优处方。正交试验因素水平见表4，试验结果见表5。通过直观分析可知，对片剂质量影响程度大小为A ＞C ＞B、D，最佳处方组成为A3B3C3D1，即6%普鲁兰多糖、6%甘露醇、0.05%三氯蔗糖、4%柠檬香精、2%蔗糖。

表4 因素水平表Tab 4 Factor and level

2.4 冻干工艺的筛选

2.4.1 共晶点的测定 共晶点是指物料中的水分完全冻结成冰晶时的温度。本试验采用电阻法测量，利用共晶点测试仪测得处方溶液的电阻值随温度的变化情况，作电阻-温度散点图，如图1。可知，当温度开始下降至－22℃时，电阻值开始增大，当温度降至－40℃时，电阻值达到最大，此时的温度为溶液的共晶点温度。继续降温一段时间后开始升温，当温度升至－28℃后，电阻值持续减小，－28℃为溶液的共熔点温度。以溶液的共晶点和共熔点温度作为参考调整冻干工艺。

表5 正交试验结果Tab 5 Experimental results

图1 共晶点和共熔点Fig 1 Eutectic point and eutectic melting point

2.4.2 冻干工艺的筛选 冻干工艺直接影响片剂的外观和微观结构，进而影响崩解。采用优化得到的处方进行制备，以冻干片的外观、崩解时间和微观结构为指标对冻干曲线进行筛选。冻干曲线变化如下：

预试验曲线：升温至－32℃进箱，－30℃维持30 min；升温至－15℃，维持1 h；升温至25 ℃，维持1.5 h。升温速率均为1 ℃·min－1，真空度范围为10 ～20 Pa。

曲线一：升温至－32 ℃进箱，－30 ℃维持1 h；升温至－20 ℃，维持1 h；升温至－10 ℃，维持1 h；升温至25 ℃，维持1 h。

曲线二：升温至－32 ℃进箱，－30℃维持1 h；升温至－15℃，维持1 h；升温至0℃，维持1 h；升温至25℃，维持1 h。

曲线三：－32℃进箱，升温至－30℃维持2 h；升温至－15℃，维持1 h；升温至25℃，维持1 h。

曲线四：－32 ℃进箱，升温至－30℃维持30 min；升温至－20℃，维持1.5 h；升温至0℃，维持1 h；升温至25℃，维持1 h。

表6 冻干曲线的筛选Tab 6 Screaning of freeze-drying curve

曲线五：－32℃进箱，升温至－30 ℃维持30 min；升温至－20℃，维持2 h；升温至25 ℃，维持1.5 h。

筛选结果如表6 所示，微观结构如图2。综合选择曲线四为最优冻干曲线。

2.5 工艺验证试验

按照优选的处方工艺平行制备3 批样品，进行质量评价，3 批口崩片颜色均匀，片形饱满，表面光洁，无裂边，无融片，完整性好，微观结构排列有序，在水中快速崩解，入口即化，无沙砾感，无异味，微观结构排列有序（见图3）。制剂前后蛋白条带一致，生物效价无明显改变（见图4），证明处方工艺、冻干工艺稳定可行。可进行工艺放大研究。

3 讨论

甘露醇和普鲁兰多糖的比例和含量对片剂的基本骨架起着决定作用，当两者含量均大于4%时片剂成形性基本合格；地龙独特的腥臭味造成服药困难，三氯蔗糖和柠檬香精可矫正和掩盖不良气味，大大提高患者依从性，蔗糖常用作冻干制剂的保护剂，本试验中蔗糖用于矫味，但用量过大，片形变差，可能与其降低溶液的共晶点有关，导致冻干条件变苛刻，故仅少量使用以平衡因加入三氯蔗糖造成的味觉不适。

维持干燥箱内的低压可降低水蒸气分压，使水分能够在低温下快速蒸发，干燥的同时不会使物料的性状发生改变，在冻干过程中，真空度的稳定对保证产品的质量有重要作用。真空度越高，可在更低的温度实现升华干燥。若产品的共熔点温度低，而真空度达不到此温度下升华的要求，会因融片而导致外观塌陷，片子变硬等。维持较高的真空度并使其稳定在一定范围内是保证整个冻干过程顺利进行的重要因素，一般冻干水溶液时真空度保持在10 ～30 Pa，本试验中真空度可稳定保持在10 ～20 Pa。

图2 不同冻干工艺条件下片剂的微观结构（×100 μm）Fig 2 Microstructure feature at different freeze-drying Process（×100 μm）

升华温度过高或升温速度过快会造成片剂塌陷。一般在低于共熔点温度处进行升华干燥，但此溶液共晶点和共熔点温度低，升华温度过低造成水分蒸发很慢，致使形成的孔道很小，温度升高容易导致脆弱细小的骨架无法支撑而塌陷，缓慢的升温有利于维持其骨架结构，但耗能增大，造成崩解时间整体延长且有团块，微观结构杂乱不规则；试验选择在低于共熔点温度维持一段时间，在共熔点曲线的转折点－20℃维持较长时间，此时水分蒸发的速度加快，形成的孔隙和骨架更大，保证其不会发生塌陷，制备得到的片剂片形良好，崩解快，微观结构规则有序。

图3 3 批次微观结构（×100 μm）Fig 3 Microstructure of 3 batches（×100 μm）

图4 制剂前后蛋白条带（A）和制剂前后生物效价对比（B）Fig 4 Comparison of protein bands（A）and biological value（B）after preparation

本研究运用冷冻干燥技术制备地龙提取物口崩片，以外观、口味、崩解时间等为指标进行单因素和正交试验考察筛选处方组成，以微观结构和崩解时间为指标筛选冻干工艺，成功制备得到30 mg/片的冻干型口崩片并进行了工艺验证试验。通过最优工艺制备得到的3 批样品外观良好，崩解时间均小于10 s，微观结构排列有序，入口即化，无沙砾感。制剂前后蛋白条带以及生物效价均未发生明显改变，说明此工艺条件对地龙纤溶活性物质无显著影响，具有稳定性和可行性。