基于血小板衍生生长因子信号通路的伏力诺他抗肝纤维化作用机制研究

黎权方，李龙宽，顾军荣，赵月涵，陈应强（.贵州医科大学临床医学院，贵阳 550004；.贵州医科大学第三附属医院药学科，贵州 都匀 558000；3.贵州医科大学第三附属医院感染科，贵州 都匀 558000）

肝纤维化（liver fibrosis，LF）是慢性肝病发生发展过程中肝内细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成增加、降解相对不足引起异常沉积所发生的一种病理改变[1]。肝纤维化发生发展的关键环节是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的激活[2]。多种细胞因子可促进肝纤维化的发生、发展，其中血小板衍生生长因子（PDGF）是一种关键的促HSC 激活和迁移的纤维化细胞因子，介导肝纤维化的进程。随着组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂广泛应用于器官纤维化及癌症的治疗[3-4]，肝纤维化的组蛋白修饰也成为了当前研究的热点。研究发现HDAC 抑制剂可延缓肺纤维化的发生及发展，调控肌纤维细胞活化、增殖和ECM 蛋白的生成，通过染色质重塑等减轻肾脏纤维化的发生[5-7]。伏立诺他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA），是一种广谱HDAC 抑制剂，本实验拟通过观察伏立诺他对PDGF 刺激的HSC-T6 的增殖、迁移及细胞周期相关基因、蛋白和COLⅠ的影响，考察其抗肝纤维化作用。

1 材料

1.1 细胞

大鼠肝星状细胞HSC-T6 [Merck（中国），货号：SCC069]。

1.2 试药

DMEM/高糖培养基及胎牛血清（FBS）（美国Gibco 公司）；PDGF-BB（日本Takara 公司）；伏立诺他（货号：SML0061，规格：5 mg，白色粉末，分子量：264.32，Sigma 公司）；胰蛋白酶、RIPA缓冲液（美国Sigma 公司）；CCK-8 试剂盒（日本Dojindo 公司）；甲醇（国家标准溶液定制中心）；Trizol（日本Takara 公司）；Bestar RT-qPCR kit 及Bestar RT-qPCR MasterMix（DBI 公司）；一抗稀释液、二抗稀释液、SDS-PAGE、PVDF 膜（美国Millipore 公司）；COLⅠ抗体、CyclinD1、CyclinE1 抗体（美国Abcam 公司）；GAPDH 抗体（美国 Santa Cruz Biotechnology 公司）。

1.3 仪器

离心机（广州吉帝仪器有限公司）；－80 ℃超低温冰箱（海信容声冰箱有限公司）；化学发光成像系统、电泳槽（美国BIO-RAD）；酶标仪（华泰和合商贸有限公司）；恒温振荡器（日本Asone）；电泳仪（六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 实验分组

取对数生长期的HSC-T6 分为3 组：空白对照组（不做任何处理）、模型组（加入10 ng·mL－1PDGF-BB）[8]、伏立诺他组（先以10 ng·mL－1PDGF-BB 刺激30 min，再加入100 nmol·L－1伏立诺他作用72 h[9]）。

2.2 CCK-8 法检测细胞增殖能力

将“2.1”项下不同组HSC-T6 接种于96 孔板中培养过夜。在24、48 和72 h 在酶孔中加入10 μL CCK-8 溶液10 min 后，在450 nm 测定吸光度。

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡能力

收集经“2.1”项下方法处理后的HSC-T6，加入80%的冷乙醇。洗涤后，用50 μL·mL－1PI在4 ℃暗光下染色过夜。用流式细胞仪检测处理后的HSC-T6 的细胞周期。

2.4 Western blot 法检测蛋白表达水平

收集经“2.1”项下方法处理后的细胞，加入RIPA 缓冲液分离总蛋白，并转移至聚偏氟乙烯膜上。用含5%脱脂牛奶封闭后，把膜与相应的一抗4 ℃ 温育过夜。最后与二抗在室温下孵育1 h，用增强化学发光法显影蛋白质。以GAPDH 作为内参蛋白对各蛋白进行定量，蛋白表达水平以各组COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的灰度值除以对应的内参蛋白灰度值表示。

2.5 RT-qPCR 检测基因表达量

将对数生长期的HST-6 细胞接种于75 mL 培养瓶中，细胞生长至90%融合度时，加入PDGF-BB诱导30 min，加入含有伏立诺他100 nmol·L－1的DMEM 培养液，继续培养24 h，用Trizol 提取总RNA，用Bestar RT-qPCR 试剂盒合成cDNA，最后用Bestar RT-qPCR Master Mix 测定基因表达，用2－△△Ct法确定基因的相对表达量。

2.6 数据处理

所有数据用 SPSS 23.0 统计软件进行分析，以均数±标准差（±s）表示，采用重复检测方差分析、单因素方差分析或t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 伏立诺他对PDGF-BB 诱导的HSC-T6 增殖作用的影响

与空白对照组相比，加入PDGF-BB 对HSC-T6 的增殖有明显刺激作用；与模型组比较，伏立诺他能抑制PDGF-BB 刺激的HSC-T6 增殖，结果见表1。

表1 伏立诺他对PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

表1 伏立诺他对PDGF-BB 刺激的HSC-T6增殖的影响(±s，n＝3)Tab 1 Effect of vorinostat on HSC-T6 proliferation stimulated by PDGF-BB (±s，n ＝3)

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

组别 光密度值24 h 48 h 72 h空白对照组 0.432±0.054 0.555±0.168 0.817±0.365模型组 0.508±0.136 a 0.821±0.277 a 1.311±0.156 a伏立诺他组 0.423±0.182 b 0.601±0.136 b 0.792±0.207 b

3.2 流式细胞仪的检测结果

PDGF-BB 的激活显著降低了G0/G1期HSC-T6，增加了S 期HSC-T6，而伏立诺他治疗可以显著逆转G0/G1期和S 期HSC-T6 数量的变化，提示伏立诺他通过调节细胞周期来抑制PDGF-BB 诱导的HSC-T6的增殖（见图1）。

图1 各组HSC-T6 细胞中细胞凋亡的情况Fig 1 Apoptosis of HSC-T6 cells in each group

3.3 Western blot 结果

与空白对照组相比，模型组中COLⅠ、CyclinD1和CyclinE1 的蛋白表达显著升高（P＜0.05）；伏立诺他干预后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表达明显降低（P＜0.05）（见表2 及图2）。提示伏立诺他能显著下调PDGF-BB 激活的HSC-T6 细胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表达。

表2 HSC-T6 细胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相对灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

表2 HSC-T6 细胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白相对灰度值(±s，n ＝3)Tab 2 Relative gray value of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells (±s，n ＝3)

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。Note：Compared with the blank control group，aP ＜0.05；compared with the model group，bP ＜0.05.

组别 相对灰度值COLⅠ CyclinD1 CyclinE1空白对照组 0.2980±0.0022 0.1961±0.0050 0.2154±0.0196模型组 0.7323±0.0264a 0.7433±0.1003a 0.5386±0.1940a伏立诺他组 0.5700±0.2053b 0.4972±0.1746b 0.3861±0.2132b

图2 HSC-T6 细胞中COLⅠ，CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白表达情况Fig 2 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 in HSC-T6 cells

3.4 RT-qPCR 结果

所有引物的序列如表3 所示。与空白对照组相比，模型组中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1的表达明显升高（P＜0.05）；加入伏立诺他后，COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的表达明显降低（P＜0.05）（见表3 及图3），提示伏立诺他可以抑制PDGF-BB 诱导的HSC-T6 表 达COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1。

图3 HSC-T6 细胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的mRNA 的表达情况Fig 3 Expression of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1 mRNA in HSC-T6 cells

4 讨论

肝纤维化的主要特征是长期慢性肝脏损伤，导致静息状态下HSC 的活化并转变成肌成纤维样细胞，获得增殖并表达PDGF 等相关细胞因子的能力，使大量ECM 过度沉积。HSC 的活化受多种因素影响，其中PDGF 被认为是最强的促有丝分裂因子[10-11]。PDGF 可以与HSC 表面的PDGF 受体结合，促进HSC 的活化、增殖，介导肝纤维化的发生[12]。细胞增殖是通过细胞周期实现的，细胞在生长因子的刺激下，G1期CyclinD表达增多，CyclinE 可促进细胞通过G1/S 期的限制点进入S 期[13]。ECM 的合成主要以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原为主，其中Ⅰ型胶原约占60%，因此Ⅰ型胶原的表达水平可视为判断ECM 合成的重要指标[12]。所以，抑制HSC 的活化、增殖，促进凋亡，抑制过多的ECM 沉积成为肝纤维化防治的重要思路。组蛋白乙酰化与肝纤维化的发生关系密切，组蛋白乙酰化参与在转录后HSCs 的活化、增殖和凋亡的调控。尽管目前已开发出大量HDAC 抑制剂，但还没有有效的药物治疗人类肝纤维化。本课题以激活型的HSC-T6 为研究对象，PDGF 作为诱导因子，观察伏立诺他抑制HSC-T6 的作用，发现伏立诺他可显著逆转G0/G1期和S 期HSC-T6 数量的变化，提示伏立诺他可通过调节细胞周期来抑制PDGF-BB 诱导的HSC-T6 的增殖，促进HSC-T6 的凋亡，抑制HSC-T6 细胞中COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的蛋白及mRNA 的表达。这为伏立诺他临床抗肝纤维化的研究提供实验基础。

表3 COLⅠ、CyclinD1 和CyclinE1 的引物序列Tab 3 Primer sequences of COLⅠ，CyclinD1 and CyclinE1