中药爵床抗血小板聚集的活性物质及作用机制研究

陈鹏宇，姚云峰，张莹，柯辛格，余兵，吴和珍，3，杨艳芳，3，肖学成（1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.中药资源与中药化学湖北省重点实验室，武汉 430061；3.老年病中药新产品湖北省协同创新中心，武汉 430061）

血栓形成是由于血管或心脏内流动的血液变为固态。血栓会导致血流阻塞，引发心肌梗死或者中风等血栓性疾病，对人们的健康产生严重危害[1]；血小板是一种无核细胞，来自于骨髓巨核细胞，它的黏附、聚集、释放对于血管内血栓的形成具有重要作用。影响血小板的黏附、聚集等过程也是抗血栓药物研发的主流靶点[2-4]。阿司匹林、氯吡格雷等化学药物具有抗血小板聚集的作用，是目前临床上常用的血小板聚集抑制剂，其被广泛运用于治疗血栓性疾病[5]。但这些药物往往存在着作用机制单一、不良反应较大的缺点，难以被需要长期服药的患者所接受。故筛选安全有效的新的抗血小板聚集药物有着十分重要的意义。整合素β3主要在血小板中表达，是抗血小板治疗的首要靶点。根据课题组前期实验，初步确定爵床提取物抗血小板聚集的可能靶蛋白为整合素β3。

中药是新药研发的宝库，其安全性和有效性在几千年的药用历史中得到了检验。《神农本草经》最早收录了爵床，记载其味辛苦咸，性寒，入肝、肺、膀胱经，主治清热解毒、利尿消肿、截疟[6]。爵床中主要含有黄酮、生物碱、木脂素以及三萜类等成分，根据现代药理学研究，爵床具有镇痛、抑菌、抗炎以及抗肿瘤的作用[7-9]。课题组前期研究证实，爵床中的活性物质可以抑制血小板聚集，但具体的药效物质基础、作用机制还不完全清楚[10]。本文通过大孔吸附树脂法、制备性液相色谱法等分离纯化爵床中的活性成分，得到单体成分；构建动物模型来筛选活性物质，通过体外血小板实验和体内实验验证其药效，并初步探索抗血小板聚集的作用机制，为爵床进一步研究提供理论基础和实验数据。

1 材料

1.1 试药

爵床药材采于湖北宜昌，由湖北中医药大学药学院的吴和珍教授鉴定为爵床科植物爵床[Rostellularia procumbens（Lin.）Nees]的干燥全草。

D101 大孔吸附树脂（M0041）、角叉菜胶（C8830）（Solarbio 公 司）；LDH 试剂盒（批 号：A019-2-2，南京建成生物医药有限公司）；凝血酶（Thrombin，THR，规格：100 units，批号：T6884）、胶原（Collagen，COL，规格：25 mg，批号：C7661）及二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP，规格：100 mg，批号：A2754）（美国Sigma公司）；阿司匹林肠溶片（Aspirin，ASP，规格：100 mg/片，批号：J20171021，拜耳医药）；复方丹参片（规格：0.32 g/片，批号：Z41021966，仲景宛西制药）；罗丹明鬼笔环肽300T（批号：CA1610，上海YEASEN 公司）；RIPA 裂解液（批号：P0013B，碧云天）；Integrinβ3抗体（批号：13166）、GAPDH 抗体（批号：5174）和二抗（批号：7074）（美国Cell Signaling Technology 公司）。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦1200）、Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色谱柱、Eclipse XDB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）色谱柱（美国Agilent 公司）；LX51-F22FL/PH 荧光显微镜（日本OLYMPUS 公司）；LBY-NJ4 血小板聚集仪（北京泰利康信科技公司）；电泳仪EPS600、微型垂直电泳槽VE180（上海天能科技有限公司）；化学发光凝胶成像系统Fluor Chem FC3（美国ProteinSimple 公司）。

1.3 实验动物

SPF 级雄性KM 小鼠60 只，体质量 18 ～20 g[许可证号：SCXK（鄂）2017-0012]、普通级新西兰雄兔2 只，体质量 2 ～2.5 kg [许可证号：SCXK（鄂）2016-0011，湖北省疾病预防控制中心]；SPF级雄性SD 大鼠72 只，体质量190 ～230 g [许可证号：SCXK（鄂）2017-0012，三峡大学实验动物中心]。提供充足的水和饲料，环境温度保持在20 ～22℃，相对湿度30%～50%，每日控制照明12 h，适应性喂养7 d 后开始试验。

2 方法

2.1 筛选爵床抗血小板聚集活性部位

2.1.1 爵床活性部位的分离 取25 kg 爵床药材，粉碎，过2 号筛（24 目），按料液比1∶10（g/mL）加入80%乙醇渗漉提取后将渗漉液合并，溶剂减压回收至无醇味，即得总提取液。以D101大孔吸附树脂上样总提取液，以30%～90%乙醇梯度洗脱，得到A 组322.4 g（30%乙醇洗脱流分）、B 组107.4 g（45%乙醇洗脱流分）以及C 组160.8 g（90%乙醇洗脱流分）。将各组的洗脱液减压浓缩至近干。将适量的无水乙醇加入C 组浸膏中并超声15 min 溶解，抽滤。重复数次以除去色素，将沉淀（RPE）样品记为C1组（21.0 g），滤液记为C2组（126.6 g）。

2.1.2 爵床活性部位的筛选 将KM 雄性小鼠随机分成溶剂组、模型组、A 组、B 组、RPE 组、C2组，每组小鼠10 只。每日用0.5%CMC-Na 溶液给溶剂组和模型组小鼠灌胃，不同质量浓度的药液给A 组、B 组、C1组、C2组小鼠灌胃，药物以0.5%的CMC-Na 溶液制成混悬液。具体给药剂量由前期的急性毒性实验、预实验结果以及各组分的含量确定。A 组、B 组、C1组和C2组的药物质量浓度分别是16.1、5.4、1.1、6.3 mg·mL－1，分别相当于生药量1.25、1.26、1.3、1.24 g·mL－1。每日灌胃一次并持续7 d。最后一次给药前12 h禁食，自由饮水，给药1 h 后腹腔注射0.2%的角叉菜胶溶液将给药组与模型组小鼠造模，溶剂组腹腔注射等量生理盐水。室温控制为20℃。A 组、B 组、C1组、C2组小鼠给药的体积为0.2 mL/10 g，腹腔注射角叉菜胶溶液的体积为0.1 mL/10 g。造模12 h 后根据小鼠黑尾程度计算黑尾率，黑尾率（%）＝小鼠黑尾部分长度/小鼠尾全长×100%

2.1.3 爵床活性部位的成分检测 称取RPE 50 mg 置于10 mL 量瓶中，以一定量的乙腈超声30 min 使之溶解，冷却后用乙腈定容，充分摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液进样检测。

液相分析采用Eclipse XDB-C18色谱柱；以水（A）-乙腈（B）作为流动相，梯度洗脱（0 ～8 min，45%B；8 ～12 min，45%～65%B；12 ～20 min，65%B；20 ～25 min，65%～45%B）；流速0.6 mL·min－1；柱温30℃；紫外检测波长256 nm；进样量10 μL。

2.1.4 爵床活性部位化学成分的分离纯化 用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱进一步从 RPE 中制备单体化合物。乙腈溶解RPE 样品，流动相为50%乙腈，等度洗脱，柱温30℃，流速4 mL·min－1，紫外检测波长 256 nm。将5 个色谱峰的溶液对应收集后，浓缩并回收溶剂，干燥。

2.2 体外的爵床活性物质抗血小板聚集实验

2.2.1 爵床活性物质的细胞毒性实验 取新西兰兔耳缘静脉处血，收集到含3.8%枸橼酸钠的真空采血管中，得抗凝血液。将其在1800 g 下离心10 min 后取上清液，为富血小板血浆（PRP）。下层液体用1800 g 离心18 min 后取上清液制备贫血小板血浆（PPP），将PRP 调整为3.5×108个·mL－1，与空白溶剂、PRE 溶液（0.25 ～4.00 mg·mL－1）、爵床脂定B（JDB）溶液（0.05 ～0.80 mg·mL－1）、金不换甲醚（CME）溶液（0.06 ～0.96 mg·mL－1）分别在37℃下孵育10 min，然后500 g 离心10 min 后，取上清液，试剂盒检测各组LDH 含量。同时直接将PRP 离心，取上清液测血小板的总LDH 含 量。计算LDH 释放率，LDH 释放率（%）＝待测样品LDH 含量/总LDH 含量×100%

2.2.2 血小板黏附实验 将圆形盖玻片清洗干净后放至24 孔板中，每孔加入200 μL 的COL（5 μg·mL－1）或1% BSA 溶液对照，4℃过夜后吸出包被液，加入200 μL 的1% BSA 溶液，封闭60 min 后弃去液体，用1×PBS 液清洗3 次，每孔加入200 μL“2.2.1”项下制备好的PRP，各浓度的药液以及空白溶剂同样分别加200 μL 复方丹参片（55.0 mg·mL－1）、ASP（2.0 mg·mL－1）、JDB（0.20 mg·mL－1）、CME（0.24 mg·mL－1）、RPE-L（低浓度，0.25 mg·mL－1）、RPE-M（中浓度，0.50 mg·mL－1）、RPE-H（高浓度，1.0 mg·mL－1）溶液，37℃孵育90 min，之后吸弃培养液并漂洗3 次，用4%的多聚甲醛溶液固定20 min，弃去液体并漂洗3 次，以罗丹明鬼笔环肽250 μL 避光染色30 min 后吸弃染色剂。用荧光显微镜在暗室观察，荧光染色百分比通过Image pro plus 6.0 软件计算。单体化合物JDB 和CME 的给药浓度计算由两者在RPE 中的含量换算而来。

2.2.3 体外抗血小板聚集率的测定 待血小板聚集仪测试孔中的温度达37℃，将PPP 和PRP置入测量杯中，以PPP 为对照，透光率调节为100%，然后取下PPP，将PRP 放入，向PRP 加入空白溶剂或各溶度的药物（浓度与“2.2.2”项下一致），反应5 min，透光率调节为0%，加入ADP、THR、COL 3 种不同的诱导剂使其与血小板结合，进而使血小板聚集，浊度下降，透光率上升，即可测得血小板聚集率。读取300 s 内的血小板最大聚集率。

2.3 体内的爵床活性物质抗血小板聚集实验

2.3.1 大鼠尾血栓模型实验 实验分为9 组，模型组和溶剂组灌胃0.5%的CMC-Na 溶液，ASP（2.0 mg·mL－1）、复方丹参片（570 mg·kg－1）、JDB（4.2 mg·kg－1）、CME（5.1 mg·kg－1）、RPE-L（低剂量，5.0 mg·kg－1）、RPE-M（中剂量，10.0 mg·kg－1）、RPE-H（高剂量，20.0 mg·kg－1）组以对应浓度药液灌胃，不间断灌胃7 d，每日一次，最后一次给药前12 h 停止喂食，自由饮水，并且于给药后1 h 造模。溶剂组腹腔注射等量的生理盐水，模型组和各浓度给药组每只以0.5 mL/100 g 的0.4%角叉菜胶溶液腹腔注射造模。造模12 h 后观察各组大鼠尾部的血栓情况，计算黑尾率；以7%水合氯醛将大鼠麻醉后，通过腹主动脉取血8 mL，取其中6 mL 与抗凝剂混匀后离心，剩余2 mL 不加抗凝剂，待凝固后离心，取上层液即为血清。并计算肝系数，肝系数（%）＝大鼠肝质量/大鼠体质量×100%

2.3.2 体内给药抑制血小板聚集率实验 将“2.3.1”项下得到的抗凝血用“2.2.1”项下方法得到PRP 和PPP，按“2.2.3”项下方法检测血小板聚集率。

2.4 Western blot 实验

将PRP 低速离心，获得血小板沉淀物。总蛋白提取采用RIPA 裂解缓冲液。样品用SDSPAGE 电泳分离，转至NC 膜上，将NC 膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，然后用TBST 洗膜3 次，每次10 min。洗涤后，用HRP 抗偶联二抗孵育1 h。以相同的方式清洗膜。用FluorChem FC3 系统进行显影。

2.5 统计学分析

用SPSS 19.0 软件分析，统计结果使用单因素方差分析，并以均值±标准差表示。P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 爵床活性部位筛选情况

如图1，溶剂组黑尾率为0，且小鼠尾部未形成血栓，模型组和给药组都有血栓形成。与模型组相比，给药各组黑尾率都显著下降（P＜0.05），且C1组黑尾率最低，说明C1组的抗血小板聚集作用最强，因此将C1组作为活性部位（即RPE），进行后续研究。

3.2 活性部位成分分析结果

通过HPLC 检测，并与对照品色谱峰对比，最终确定RPE 中的5 个潜在活性成分分别为6'-羟基爵床脂定B（6'-OH-JDB，1，纯度：97.23%）、爵床脂定B（JDB，2，纯度：96.50%）、金不换甲醚（CME，3，纯度：98.18%）、新爵床脂定B（NJDB，4，纯度：96.08%）和新爵床脂定A（NJDA，5，纯度：95.45%）。图2为HPLC 色谱图，图3 为化合物对应的结构式。

3.3 爵床活性物质对细胞毒性研究

根据LDH 释放率可知，血小板经过不同浓度的PRE 处理后，各浓度PRE 的LDH 释放率与溶剂组相比无明显差异（P＞0.05），不同浓度的JDB 组和CME 组与溶剂组相比无明显差异（P＞0.05），证明RPE、JDB 和CME 对血小板几乎无毒性，其抗血小板活性可能不是由于对血小板的毒性引起的（见图4）。

3.4 爵床活性物质的抗血小板黏附作用

由图5 可知，溶剂组几乎无血小板黏附，而模型组有大量的血小板黏附；与模型组相比，给药组的血小板黏附量减少（P＜0.05，P＜0.01），且RPE 的高剂量组以及复方丹参组、ASP 组的血小板黏附量最少，抗黏附作用最强，而RPE 低、中剂量组，JDB 组及CME 组抗黏附作用较ASP组弱，RPE 低剂量组作用最弱。

3.5 爵床活性物质体外抗血小板聚集的作用

诱导剂为凝血酶的情况下，与溶剂组比较，各给药组血小板聚集率（除RPE 低剂量组和CME组）都有所下降（P＜0.05，P＜0.01），而RPE高剂量组和ASP 组的血小板聚集率最低，对血小板聚集的抑制作用最强；诱导剂为ADP 时，与溶剂组比较，各给药组均能显著降低血小板聚集率（P＜0.05，P＜0.01），且RPE 高剂量组对血小板聚集率降低效果最明显；诱导剂为COL 时，与溶剂组比较，各给药组（除RPE 低剂量组）血小板集率都有所下降（P＜0.05，P＜0.01），且RPE高剂量组与复方丹参组、ASP 组的血小板聚集率更低，而CME 抗血小板聚集的作用较弱（见图6）。

3.6 爵床活性物质对大鼠尾血栓模型的保护作用

图1 各组小鼠尾血栓（a）和黑尾率（b）比较Fig 1 Tail thrombus（a）and black tail rate（b）of mice in each group of mice

图2 RPE 的HPLC 色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of RPE

图3 化合物1 ～5 的结构式Fig 3 Chemical structure for compound 1 ～5

图4 不同浓度的RPE（a）、JDB（b）及CME（c）的LDH 释放率Fig 4 LDH release rate of RPE（a），JDB（b）and CME（c）at different concentrations

图5 各给药组对血小板黏附的作用（A）及荧光染色情况（B）Fig 5 Effect of each administration group on platelet adhesion（A）and fluorescence staining（B）

溶剂组大鼠在造模12 h 后尾部没有形成血栓，而模型组和给药组的大鼠尾部均有血栓形成。与模型组相比，给药组大鼠的黑尾率均有所下降（P＜0.05，P＜0.01）。同时发现模型组大鼠的肝脏肿胀、肝脏系数增高。而给药组的大鼠肝脏系数与模型组对比均显著降低（P＜0.05），说明所给药物能够减轻肝脏肿胀，降低炎症反应，如图7所示。

图6 不同诱导剂对血小板聚集率的作用Fig 6 Effect of different inducer on platelet aggregation rate

图7 药物对大鼠黑尾率（a）和肝系数（b）的影响Fig 7 Effect of drug on rat black-tail rate（a）and liver coefficient（b）

3.7 爵床活性物质对ADP、COL、THR 诱导的体内血小板聚集的作用

与溶剂组相比，模型组的血小板聚集率显著提高（P＜0.01）；当诱导剂是THR 和COL时，与模型组对比，RPE 高剂量组、复方丹参组、ASP 组、JDB 组血小板聚集率显著降低（P＜0.05），说高剂量 的RPE，以 及ASP 和JDB 具有抗凝血酶、抗胶原诱导的血小板聚集的作用；而诱导剂是ADP 时，RPE 低剂量组与模型组对比无显著性差异（P＞0.05），其他各给药组对血小板聚集率均有降低作用（P＜0.05），结果见图8。

图8 不同诱导剂对大鼠血小板聚集率的作用Fig 8 Effect of different inducer in each administration group on platelet aggregation rate in rats

图9 大鼠血小板中β3 蛋白的表达情况Fig 9 Expression of beta 3 protein in rat platelets

3.8 爵床活性物质对角叉菜胶诱导的大鼠体内β3蛋白的影响

如图9 所示，与溶剂组比较，模型组尾血栓大鼠的血小板中β3蛋白表达量显著增高（P＜0.01）；与模型组对比；ASP 组，RPE 高、中、低剂量组均能显著下调β3蛋白的表达（P＜0.05，P＜0.01），而JDB 组 和CME 组 对β3蛋白的影响不明显。

4 讨论

在止血过程中血小板有很重要的作用，但血小板在异常时会形成血栓，进而诱发炎症以及动脉粥样硬化等病情[11-14]。相关研究认为针对血小板异常的靶向治疗有助于缓解血管疾病，但当前抗血小板药物对患者疗效有限，且具有一定毒副作用[15]，例如长期使用阿司匹林会导致胃出血，因此有必要研究更加安全有效的抗血小板药物[16]。

小鼠尾血栓实验结果表明中C1组分（RPE）具有较好的抗尾血栓活性。通过HPLC 分析发现其由5 种木脂素类化合物组成，分别是CME、6'-OH-JDB、NJDB、JDB 和NJDA[17-19]；通过制备液相色谱法，获得这5 种单体成分。JDB 和CME在活性部位中含量最高，是抗血小板聚集的主要活性物质，因此选择这两种化合物和RPE 进行后续研究[20-21]。

药物的毒性考察结果表明，LDH 释放率均在3%以下，表明爵床活性物质对血小板没有明显的细胞毒性。

体外实验中，采用比浊法研究了爵床活性物质对APP、THR 和COL 3 种诱导剂诱导的兔血小板聚集的抑制作用。发现爵床中的活性物质能有效抑制血小板聚集。体内实验中，采用角叉菜胶大鼠尾血栓模型，同样用上述3 种诱导剂诱导大鼠的血小板聚集，研究体内条件下药物对血小板聚集的影响。结果显示爵床活性物质表现出很好的体内抗血小板聚集作用。

诱导剂激活血小板后，会促使膜蛋白整合素αⅡbβ3活化，与纤维蛋白结合，形成血小板聚集。整合素αⅡbβ3由两个Ⅰ型跨膜糖蛋白αⅡb和β3通过二硫键连接而成。而血小板表面整合素β3作为主要受体影响血小板聚集并促进血栓形成[22]。实验结果证实了爵床活性物质可以下调尾血栓大鼠体内的β3蛋白的表达，表明其抗血小板聚集的作用机制与下调整合素β3有关。

综上所述，本实验首次在体内外两个层面阐释了爵床活性物质RPE、JDB、CME 的抗血小板药效，并初步研究了爵床抗血小板机制与降低整合素β3的表达有关，为进一步深入探讨爵床抗血小板聚集作用机制提供了理论支撑，为爵床资源的开发提供帮助。