异鼠李素通过减轻氧化应激改善游离脂肪酸诱导肝细胞脂质沉积

周健，杜凤，康秉文，殷草草，蒋杉，石莹，王玥，周耿瑶，秦绪军*，王枫*（.空军军医大学军事预防医学系 军队健康教育与管理教研室，西安 7003；.陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 咸阳 7046）

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指在非过度饮酒的情况下，肝脏发生的脂质沉积现象，并排除药物、自身免疫、病毒等因素造成的肝脏疾病[1]，以过量的三酰甘油（triacylglycerol，TG）在肝脏中聚积为特征[2]。NAFLD 已成为全世界人们在慢性病领域关注的焦点，我国预计在2030年成为NAFLD导致肝脏相关疾病死亡率最高的国家[3]。对于目前重症NAFLD 患者而言，除了改变不健康的生活方式之外，急需能够有效治疗NAFLD 的药物。NAFLD 发病机制复杂，致病因素众多。目前“多重打击学说”认为形成NAFLD 的因素包括肝脏TG 沉积，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR），自噬能力减弱，炎性因子刺激以及氧化应激（oxidative stress，OS）等[4]。有研究表明，当大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）发生OS 时，线粒体功能受到抑制，核因子相关因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）与其内生的抑制剂Kelch 样ECH 相关蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1，keap1）的分离可能会受到抑制，影响抗氧化基因表达，形成恶性循环，使细胞功能受损，诱发脂质沉积[5]。因此抗氧化是防治NAFLD 的重要研究内容之一。

异鼠李素（isorhamnetin，Iso）由沙棘中分离而得，是黄酮类化合物槲皮素的直接代谢产物之一[6]。沙棘具有缓解咳嗽，促进食欲的功效，被广泛用于治疗轻症的呼吸系统炎症、高原肺病、食欲不振等[7]。近几年，异鼠李素更是被证明具有保护心血管、抗炎、调节免疫、抗肿瘤、缓解肝脏纤维化等多种作用[8-11]。此外，异鼠李素抗氧化能力较强[9，12-13]，能调节Nrf2 通路，从而增强血红素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）等抗氧化基因的表达，缓解超氧化物歧化酶（SOD）过分消耗，减少ROS产生，从而缓解OS，起到抗氧化保护作用[14-15]。异鼠李素是否可以通过调节Nrf2 通路来缓解OS造成的损伤从而减轻NAFLD，尚不明确。本研究采用游离脂肪酸（FFA）构建体外脂质沉积模型，观察异鼠李素对细胞产生的ROS、抗氧化系统以及TG 沉积的变化影响，初步探讨异鼠李素抗NAFLD 的可能性及其分子机制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

二氧化碳孵育箱（美国Thermo）；紫外线超净台（江苏苏净安泰）；台式离心机（陕西环宇）；CKX41 倒置显微镜（日本Olympus）；高速冷冻离心机5424 R（德国Eppendorf）；Infinite200 PRO 全波长多功能酶标仪（德国Tecan）；流式细胞仪（美国BD）；Trans Blot Turbo 蛋白转印系统、蛋白电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad）。

1.2 试药

异鼠李素（美国TargetMol，纯度≥98%，批号：T2836）；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培养基（美国Gibco）；蛋白定量分析试剂盒（美国Thermo）；青-链霉素溶液（上海源培）；油红O、荧光探针（美国Sigma）；过氧化氢酶（CAT）试剂盒、总SOD 试剂盒（上海 Beyotime）；苏木精（珠海贝索）；TG 试剂盒（日本Wako）；CCK-8试剂盒（上海汉恒）；浆蛋白核蛋白提取试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（江苏凯基）；Actin、CAT、SOD1、GPx1、GCLM 兔 抗单 克隆抗 体、SOD2 鼠抗单克隆抗体（美国Santa Cruz）；Nrf2兔抗单克隆抗体（武汉 Proteintech）；GCLC 兔抗单克隆抗体（南京巴傲德）；HO-1 兔抗单克隆抗体（英国Abcam）；ML385（美国TargetMol）。

2 方法

2.1 L-02 细胞培养与处理

人肝L-02 细胞（由中科院上海细胞库购买）接种于含10% FBS、1%青-链霉素的DMEM 高糖培养基中，在37℃、5% CO2的孵育箱中培养。取处于对数生长期细胞，均匀接种于96 孔板（用于CCK-8 实验）与6 孔板（用于蛋白水平表达等其他测定）中。油酸与棕榈酸按2∶1 的比例溶于BSA中配制成FFA[14]。将细胞分为3 组：对照（control）组，FFA 组，FFA ＋Iso 组。其中FFA 浓度为0.6 mmol·L－1，异鼠李素浓度为10 μmol·L－1，共处理7 d。每组设立3 个平行样。

2.2 细胞活力检测

采用CCK-8 细胞增殖试剂盒检测细胞活力。取对数生长期细胞按说明书均匀接种于96 孔板，分别给予0、5、10、20、40、80 μmol·L－1的异鼠李素培养24 h，再用10 μL CCK-8 溶液进行反应，37℃孵育2 h，在450 nm 处测定吸光度。

2.3 油红O 染色

油红O 充分溶于异丙醇中，过滤后配制5 g·L－1的储存液，与超纯水按3∶2 混合，过滤后配制成油红O 工作液。4%多聚甲醛处理细胞30 ～60 min 用于固定，60%异丙醇孵育3 min，油红O 工作液孵育5 min。苏木素孵育1 min 后进行清洗，直到呈现紫蓝色，显微镜下观察[15]。

2.4 细胞TG 检测

采用TG 试剂盒，通过GPO-DAOS 法测定细胞中TG 含量。按照试剂盒的说明进行操作：细胞用RIPA 裂解液常规裂解，4℃、14 000 g 离心20 min 后取上清液。检测液A 与B 按1∶1 混合。取2 μL 上清液加入300 μL 混合好的检测液，37 ℃孵育至少30 min，在600 nm 处测定吸光度。

2.5 细胞总ROS 检测

采用2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFHDA）荧光探针标记，流式细胞仪检测荧光强度[16]。L-02 细胞消化重悬，加入浓度为10 μmol·L－1的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min，孵育完成清洗3 次，重悬后用流式细胞仪FL-1通道测定平均荧光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。

2.6 细胞MDA 含量、总SOD 活性和CAT 活性检测

在样品充分裂解后，按照说明进行操作，测定MDA、总SOD 活性及CAT 活性。MDA 荧光强度检测采用激发波长515 nm、发射波长553 nm。总SOD 活性采用450 nm 波长测定吸光度，CAT 活性采用520 nm 波长测定吸光度。

2.7 核蛋白与浆蛋白提取

采用核蛋白、浆蛋白提取试剂盒提取核蛋白及浆蛋白，在细胞中加入预冷的450 μL Buffer A与50 μL Buffer B，混匀，冰上放置30 min。4℃、3000 g 离心10 min，上清液即为胞浆蛋白。沉淀加入100 μL Buffer C，涡旋震荡15 s，冰上裂解60 min。4 ℃、14 000 g 离心30 min，上清液即为核蛋白。

2.8 Western blot

依照BCA 法，测定蛋白浓度。配制相应浓度的凝胶依次上样，恒压150 V 电泳60 min。电泳结束后，将蛋白转移至PVDF 膜上。5%脱脂奶粉室温孵育2 h。一抗在4 ℃孵育12 h，用TBST洗膜，共3次。二抗在25℃孵育2 h，TBST 洗膜，共4 次。发光液A 与发光液B 按1∶1 混匀，覆于PVDF 膜表面，并用凝胶成像进行成像。最后采用Bio-Rad Quantity One 软件对条带进行定量分析。

2.9 统计学分析

通过SPSS 22.0 统计分析软件，实验数据以±s形式表示。多组间数据采用单因素方差分析（One-way ANOVA），运用Dunnett’st检验比较实验组与对照组之间的统计学差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 异鼠李素对L-02 细胞活力的影响

当 浓度≤20 μmol·L－1时，异鼠 李 素对细胞活力的影响无显著区别；而当浓度≥40 μmol·L－1时，细胞活力显著降低（见图1）。因此，为了避免细胞活力受影响，选择浓度为10 μmol·L－1的异鼠李素进行干预。

3.2 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中TG 水平的影响

与Control 组相比，经FFA 处理的细胞红色斑点大量生成，TG 水平显著提高；而经异鼠李素干预后，红色斑点显著减少，表明细胞内TG水平显著下降（见图2）。

图1 不同浓度的异鼠李素处理后对L-02 细胞活力的影响（24 h）Fig 1 Effect of different concentrations of isorhamnetin on the viability of L-02 cells（24 h）

图2 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中TG 水平的影响（7 d）Fig 2 Effect of isorhamnetin on TG level in L-02 cells induced by FFA（7 d）

3.3 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中总ROS及MDA 水平的影响

与Control 组相比，FFA 组的总ROS 水平与MDA 水平均显著增高，表明FFA 可诱导细胞发生OS，使细胞受损；而经异鼠李素干预后，细胞总ROS 水平与MDA 水平均明显降低，表明异鼠李素可以有效缓解FFA 造成的OS 损伤（见图3）。

3.4 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中抗氧化酶的影响

与Control 组相比，FFA 组SOD1、SOD2、GPx1的表达水平均显著下降；在异鼠李素干预后，SOD1、SOD2、GPx1 的表达水平显著提高（见图4A）。除此之外，FFA 可显著降低L-02 细胞总SOD 活性，而异鼠李素干预后总SOD 活性显著增加（见图4B）。

3.5 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中Nrf2 蛋白及其下游蛋白水平的影响

图3 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞的总ROS 与MDA 水平的影响（7 d）Fig 3 Effect of isorhamnetin on total ROS and MDA level in L-02 cells induced by FFA（7 d）

图4 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞的抗氧化酶的影响（7 d）Fig 4 Effect of isorhamnetin on anti-oxidases in L-02 cells induced by FFA（7 d）

FFA 处理后L-02 细胞胞核内的Nrf2 蛋白水平显著下降，Nrf2 下游的GCLC、GCLM 的表达水平也显著下降。与FFA 组相比，异鼠李素干预后细胞质中的Nrf2 蛋白（cyt Nrf2）水平显著下降，而细胞核中的Nrf2 蛋白（nuc Nrf2）水平则显著升高（见图5A）；Nrf2 下游的蛋白表达水平也有显著提高（见图5B）。

3.6 抑制Nrf2 后异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中TG 水平的影响

与Control 组相比，FFA 组TG 水平显著升高，而异鼠李素进行干预后TG 水平有明显的下降，表明异鼠李素可以减轻FFA 诱导的脂质沉积。而在应用Nrf2 特异性抑制剂ML385（1 μmol·L－1）与异鼠李素共同处理后，细胞内TG水平明显回升，表明Nrf2 在受到抑制后，异鼠李素缓解脂质沉积的作用下降，进一步表明异鼠李素可能是通过调节Nrf2 通路缓解FFA 诱导的脂质沉积（见图6）。

图5 异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中Nrf2 蛋白及其下游蛋白水平的影响（7 d）Fig 5 Effect of isorhamnetin on Nrf2 and its downstream proteins in L-02 cells induced by FFA（7 d）

图6 抑制Nrf2 后异鼠李素对FFA 诱导的L-02 细胞中TG 水平的影响（7 d）Fig 6 Effect of isorhamnetin on the TG level in L-02 cells induced by FFA after the inhibition of Nrf2（7 d）

4 讨论

OS 是ROS 生成超过抗氧化的能力时出现的一系列应激反应，与NAFLD 的发生有着密切的联系。过量的游离脂肪酸在肝细胞线粒体内发生β氧化，造成ROS 的不断聚积，影响线粒体的活性，导致脂肪酸转化为TG 储存在肝细胞内，进一步破坏线粒体结构与功能，产生更多的ROS[17]，大量TG 沉积在肝脏中最终形成NAFLD。而NAFLD 的形成也进一步使肝细胞受到脂质毒性的侵害，加重线粒体的破坏，产生更多的ROS，从而诱导IR与炎症的发生，进一步使OS 损伤加剧，形成恶性循环[18]。因此，通过减少ROS 成为预防或治疗NAFLD 的潜在有效手段[19]。

异鼠李素具有保肝的作用，可以有效缓解多种因素引起的肝细胞坏死与凋亡，这其中的机制可能与抗氧化相关[20]。在本研究中，我们发现FFA 可以诱导L-02 细胞发生脂质沉积，并且可以引起细胞发生OS 损伤，产生大量ROS，消耗多种抗氧化酶。而异鼠李素则可以有效缓解FFA诱发的脂质沉积，减少细胞中TG 的水平，并且缓解OS 损伤，减少ROS 与MDA 的水平，提高SOD1、SOD2、GPx1 的表达与活性，表明异鼠李素可能通过抗氧化来缓解脂质沉积。Nrf2 是上游重要的抗氧化转录因子，其调控机制尚不完全明确。但目前普遍的观点认为，当遇到亲电物质攻击或是发生磷酸化使其构象发生改变[21]，Nrf2就会与keap1 分离进入细胞核，与一个小蛋白形成异二聚体，并识别抗氧化反应原件（antioxidant response element，ARE）序列，加强下游抗氧化蛋白表达，从而减轻ROS 带来的破坏，维持细胞的稳态[22]。此外，当keap1 发生构象的改变或是Nrf2 mRNA 水平上调，都可以促使Nrf2 通路的激活。我们进一步的研究发现，异鼠李素可以通过调控Nrf2 信号通路，促进Nrf2 进入细胞核，从而提高HO-1、GCLC、GCLM 的表达水平。这些结果表明异鼠李素可能是通过提高Nrf2 的转录活性，减轻了OS，从而缓解了FFA 诱导的脂质沉积。接下来本课题组应用Nrf2 的特异性抑制剂，发现异鼠李素缓解脂质沉积的作用减弱，细胞中TG 水平增加，这进一步表明Nrf2 通路是异鼠李素缓解脂质沉积的重要通路。Ganhold等[23]的研究证明异鼠李素可以缓解小鼠肝脏中的脂质沉积，其中的机制可能与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptorγ，PPARγ）通路有关。PPARγ通路与脂质合成相关，而有文献报道Nrf2 可以调控PPARγ通路，因此异鼠李素还有可能通过调控Nrf2 抑制脂肪从头合成，从而缓解脂质累积[24]。

综上所述，本研究采用NAFLD 体外细胞模型，发现异鼠李素可显著缓解FFA 引起的OS，提高细胞抗氧化的能力，降低FFA 诱导的脂质沉积，而调控Nrf2 通路是其中抗氧化的重要机制。该研究结果为进一步研究异鼠李素防治NAFLD提供了实验依据。