白芦笋鲜汁及残渣醇提物不同极性部位的免疫活性研究

罗亮，李欣蔓，马靖宜，林居纯，符华林，顾健，何黎黎，袁志翔*（.西南民族大学药学院，成都 6004；.四川农业大学动物医学院，成都 630）

随着中药在国际市场的日渐渗透，对于免疫抑制的治疗，人们将目光投向了“药食同源”的中药材[1]。芦笋（Asparagus.）俗称石刁柏、龙须菜等，是天门冬科天门冬属多年生草本植物石刁柏的幼苗，可供蔬食，是国际上公认的防癌保健蔬菜[2]。芦笋不仅含有多糖、黄酮类、皂苷类化合物等多种功能成分，还富含具有多种特殊生理功能的氨基酸，尤其是天冬氨酸和谷氨酸[3]。芦笋幼苗因未出土而呈白色，故被称为白芦笋，出土后呈绿色被称为绿芦笋。研究发现绿芦笋富含叶绿素，白芦笋含丰富的微量元素、多种氨基酸、蛋白质和维生素[4]。芦笋的免疫作用受到了医学研究领域的重点关注，芦笋汁对中枢及周围免疫器官中T 淋巴细胞的增殖均有刺激作用[3]；芦笋的醇提物可以显著增强脾淋巴细胞增殖能力，显著提高血清溶血素含量，并具有剂量依赖性[5]。

然而，目前工业化生产中，对芦笋榨汁后残渣一般作废弃物处理，造成环境危害和资源浪费，为进一步开发和利用芦笋，本课题研究了白芦笋鲜汁以及榨汁后残渣醇提物中不同极性部位对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。

1 材料

1.1 动物

SPF 级昆明种小白鼠，体质量（20±2）g，雌雄各半，共80 只[成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK（川）2020-030]。饲养条件：12 h 光照/12 h 黑暗，温度为（25±3）℃，湿度为35%～60%，自由进食及饮水。

1.2 试药

新鲜白芦笋（四川汇诚药业有限公司，西南民族大学中药教研室任艳老师鉴定为正品）；环磷酰胺（粉末，纯度：97%，上海源叶生物科技有限公司，批号：X22D8Y51136）；黄芪多糖（粉末，纯度：70%，成都乾坤动物药业股份有限公司，批号：20180901）；苏木素-伊红生化试剂（鸿泉生物有限公司，批号：20190103）；淋巴细胞分离液（华奥生物医药有限公司，批号：180706）；IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γELISA 试 剂盒（武 汉贝 茵莱生物科技有限公司，批号：201905）；CCK-8 试剂（MedChemExpress，批号：25090117）；刀豆蛋白（ConA，Sigma，批号：218L032）；脂多糖（LPS，批号：320V301，Sigma 美国）。

1.3 仪器

DZF-6020 真空干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；SHZ-ⅢD 循环水真空泵、RE52CS 旋转蒸发器、HH-6J 恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；BC-2800VET 兽用全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；ST16R高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；ESj180-4 型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

2 方法

2.1 白芦笋鲜汁及残渣提取物的制备

将新鲜白芦笋洗净、晾干、切断、榨汁，过滤离心收集滤液即得白芦笋鲜汁，分装储存于－20℃下备用。剩余残渣烘干，加入15 倍体积75%乙醇，超声提取1 h，共提取2 次。合并提取液，减压浓缩，干燥至恒重，得到醇提物浸膏。浸膏用适量蒸馏水分散，采用系统溶剂法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，各萃取3 次，每次30 min。合并各相萃取液，余下分散液置于高速冷冻离心机中4000 r·min－1离心15 min，弃去不溶物沉淀，减压下回收溶剂即得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物，脂溶性提取物用2%吐温80 溶液乳化备用。

2.2 动物分组及给药

小鼠适应性喂养1 周后，按体质量随机分成10 组，每组8 只，雌雄各半。分别为：空白组、模型组、黄芪多糖组（阳性组）、鲜汁低剂量组、鲜汁中剂量组、鲜汁高剂量组、石油醚部位组、乙酸乙酯部位组、正丁醇部位组、水部位组。除空白组外，其余组腹腔注射80 mg·kg－1环磷酰胺造模，空白组采用等量生理盐水腹腔注射，连续3 d，构建免疫抑制小鼠模型[6]。造模成功后，鲜汁低、中、高剂量组依次用5、10、20 mL·kg－1鲜汁灌胃。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位组每日用50 mg·kg－1相应提取物溶液灌胃。阳性组用50 mg·kg－1黄芪多糖灌胃。空白组和模型组每日灌胃等量生理盐水，连续灌胃7 d。末次给药24 h 后禁食禁水，处死小鼠，进行脏器指数测定、细胞因子含量检测及脾淋巴细胞增殖实验。

2.3 脏器指数测定

称取小鼠质量，乙醚麻醉后处死小鼠。取其胸腺、脾脏及肝脏，去除表面无关结缔组织，生理盐水洗净后放于滤纸吸干脏器表面水分后称重，计算胸腺、脾脏及肝脏指数。脏器指数＝脏器质量（g）/体质量（100 g）[7]。

2.4 细胞因子的测定

取小鼠血清，按照ELISA 试剂盒说明书，分别进行小鼠细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的检测[8]。

2.5 脾淋巴细胞增殖

取小鼠脾脏，用PBS 湿润，无菌条件下研磨获得脾细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，台盼蓝染色计数活细胞数，用RPMI-1640完全培养液调节细胞密度至1×105个/ 孔，每孔加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培养液，各剂量组又分别设刀豆蛋白A（ConA，终质量浓度为10 μg·mL－1）、脂多糖（LPS，终质量浓度为5 μg·mL－1）、不加ConA 或者LPS 空白培养孔。37℃、5%CO2培养48 h，每孔加20 μL CCK-8，继续培养4 h。于酶标仪450 nm 波长下测定吸光度（OD）值[9]。计算各条件下淋巴细胞的增殖率，增殖率（%）＝ODConA/LPS/ODS×100%，ODConA/LPS表示含有ConA 或LPS 的RPMI-1640 培养基中脾淋巴细胞测得的光密度值，ODS表示RPMI-1640 培养基中脾淋巴细胞测得的光密度值。

2.6 数据处理

所有数据采用SPSS 22.0（IBM，USA）进行分析，以平均值±标准差（SD）表示，采用单因素方差分析（ANOVA）及邓肯检验比较各组间的显著差异。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 脏器指数测定

由表1 可知，与空白组相比，模型组胸腺指数、脾脏指数及肝脏指数均明显变小（P＜0.05），表明环磷酰胺免疫抑制小鼠造模成功。鲜汁低、中、高剂量组肝脏指数、胸腺指数及脾脏指数与模型组相比，均明显增大（P＜0.05），与黄芪多糖阳性组以及空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。鲜汁中剂量组恢复上述脏器指数能力更强，但不存在显著的剂量-效应关系。

表1 白芦笋鲜汁对小鼠脏器指数的影响(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 1 Effect of white asparagus fresh juice on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

表1 白芦笋鲜汁对小鼠脏器指数的影响(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 1 Effect of white asparagus fresh juice on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

注：不同上标字母表示差异具有统计学意义。Note：Different superscripts indicate that the difference is statistically significant.

组别 胸腺指数 脾脏指数 肝脏指数空白组 0.201±0.0137a 0.415±0.0325a 5.877±0.416a模型组 0.132±0.0092b 0.322±0.0314b 5.055±0.248b黄芪多糖组 0.201±0.0126a 0.412±0.0274a 5.898±0.284a鲜汁低剂量组 0.190±0.0134a 0.391±0.0238a 5.824±0.340a鲜汁中剂量组 0.204±0.0138a 0.415±0.0272a 5.896±0.334a鲜汁高剂量组 0.186±0.0281a 0.392±0.0264a 5.787±0.332a

由表2 可知，与模型组相比，白芦笋残渣醇提物不同极性部位组中石油醚部位、乙酸乙酯部位组小鼠脏器指数差别无统计学意义（P＞0.05），随着萃取溶液极性的增大，正丁醇部位、水部位组小鼠脏器明显增大（P＜0.05），表明白芦笋残渣醇提物中高极性提取物增加免疫低下小鼠的脏器指数效果明显。

表2 不同极性部位提取物对小鼠脏器指数的影响(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 2 Effect of different polarity fractions on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

表2 不同极性部位提取物对小鼠脏器指数的影响(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 2 Effect of different polarity fractions on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

注：不同上标字母表示差异具有统计学意义。Note：Different superscripts indicate that the difference is statistically significant.

组别 胸腺指数 脾脏指数 肝脏指数空白组 0.201±0.0137a 0.415±0.0325a 5.877±0.416a模型组 0.132±0.0092b 0.322±0.0314b 5.055±0.248b黄芪多糖组 0.201±0.0126a 0.412±0.0274a 5.898±0.284a石油醚部位组 0.136±0.0093b 0.329±0.0268b 5.068±0.205b乙酸乙酯部位组 0.143±0.010b 0.337±0.0292b 5.205±0.239b正丁醇部位组 0.166±0.0129c 0.371±0.0142c 5.506±0.205c水部位组 0.177±0.0147c 0.383±0.0172c 5.734±0.228ac

3.2 细胞因子测定

白芦笋鲜汁对小鼠血清细胞因子的表达结果见图1。与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量均显著降低（P＜0.05）。给药治疗后，黄芪多糖组及低、中、高白芦笋汁组血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量均较模型组显著升高（P＜0.05），与空白组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。与黄芪多糖组相比，3 个剂量白芦笋鲜汁组小鼠血清中上述细胞因子浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。白芦笋汁3 个剂量组之间，中剂量组小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的含量高于低、高剂量组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明白芦笋鲜汁各剂量组均能较好地上调免疫低下小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量。

图1 白芦笋鲜汁对小鼠细胞因子的影响Fig 1 Effect of white asparagus fresh juice on cytokines in mice

白芦笋残渣醇提物不同极性部位对小鼠细胞因子的影响结果见图2。由图2 可知，与模型组相比，石油醚组、乙酸乙酯组小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量差异无统计学意义（P＞0.05），正丁醇部位组、水部位组小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量明显增加（P＜0.05），且水部位组细胞因子较正丁醇部位组高，表明白芦笋渣醇提取物中存在免疫活性物质，且可能为高极性化合物，其对促进免疫抑制小鼠细胞因子的释放具有上调作用。

图2 不同极性部位提取物对小鼠细胞因子的影响Fig 2 Effect of different polarity fractions on cytokines in mice

3.3 脾淋巴细胞增殖率

白芦笋鲜汁脾淋巴细胞增殖率见图3。与空白组相比，模型组小鼠脾淋巴细胞经ConA 或LPS 刺激后增殖率均显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，阳性对照黄芪多糖组脾淋巴经ConA或LPS 刺激后增殖率均显著增加（P＜0.05）。低、中、高3 个剂量组白芦笋鲜汁的脾淋巴细胞增殖率均显著高于模型组（P＜0.05）。结果表明，白芦笋鲜汁对免疫低下小鼠的脾淋巴细胞增殖率有促进作用。

图3 白芦笋鲜汁对脾细胞增殖率的影响Fig 3 Effect of white asparagus fresh juice on splenic lymphocyte proliferation rate

不同极性部位脾淋巴细胞增殖率见图4。与空白组相比，黄芪多糖组脾淋巴细胞经ConA、LPS 刺激后增殖率无显著差异（P＞0.05），但其余各组小鼠脾淋巴细胞经ConA、LPS 刺激后增殖率均显著下降（P＜0.05）。与模型组相比，石油醚、乙酸乙酯部位组小鼠脾淋巴细胞增殖率无统计学意义（P＞0.05），正丁醇、水部位组小鼠脾淋巴细胞增殖率明显增加（P＜0.05）。提示白芦笋渣醇提取物中存在有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的物质，该物质集中在高极性部位中。

图4 不同极性部位提取物对脾细胞增殖率的影响Fig 4 Effect of different polarity fractions on splenic lymphocyte proliferation rate

4 讨论

脏器指数是动物某脏器的质量与其体质量比值，动物机体受到损伤后，脏器指数也随之改变[10]。白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素三类细胞因子常用于评价机体免疫能力的强弱[11-12]。脾淋巴细胞增殖实验已被广泛用于分析淋巴细胞的反应性，常作为测定机体免疫功能的指标之一[13]。因此，本研究选取上述指标评价白芦笋鲜汁及残渣醇提物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。

对不同剂量白芦笋鲜汁的研究发现，各剂量组均能较好地提高免疫低下小鼠的脏器指数，血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的水平，促进脾淋巴细胞的增殖，但各剂量组之间差异无统计学意义，未体现出剂量-效应关系。虽然3 个剂量组之间无明显差异，但10 mL·kg－1剂量组上述指标高于5、20 mL·kg－1剂量组，为此，考虑白芦笋鲜汁是否具有双向免疫调节作用[14-15]。这一结果为白芦笋鲜汁后续研究提供了新的研究思路。

对白芦笋渣醇提物不同极性部位的研究发现，低、中极性部位组免疫低下小鼠脏器指数，血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平，脾淋巴细胞增殖率与模型组相比无显著变化，而高极性部位组免疫抑制小鼠的上述指标显著增加。提示白芦笋渣醇提物中含有免疫增强物质，且该物质可能为高极性化合物。田颖刚等[3]对芦笋下脚料乙醇提取物活性成分研究发现，75%乙醇提取物中皂苷含量为18.20%、多糖含量为14.86%，总游离氨基酸含量为12.63%。王芳等[5]用75%乙醇提取风干芦笋，得到芦笋的多种活性成分，其主要包括芦笋皂苷、芦笋多糖和多种游离氨基酸，结合相关研究，推测正丁醇、水部位中提取物可能是氨基酸、多糖以及水溶性苷类成分。这将为以后对白芦笋残渣的免疫活性物质研究提供参考依据。