怀山药内生真菌Alternaria sp.L12的次生代谢产物研究

刘明爽，田若丹，葛梦焕，文春南，王旭光，刘淼*，麻兵继，*（.河南农业大学农学院 中药材系，郑州 450046；.河南白云牧港生物科技有限公司，河南 登封 45400）

内生真菌是植物生活史的部分或全部阶段定殖于健康植物组织中，同时又不引起植物发生明显病变的真菌[1]。研究表明，植物内生真菌是结构多样、生物活性广泛的天然产物的重要来源[2]，已成为药物先导化合物发现的重要途径。同时，有些植物内生真菌具有促进宿主植物生长发育、增强其抗逆性等作用[3]。因此，针对植物内生真菌的研究引起了越来越多的关注。

薯蓣（Dioscorea oppositaThunb.）为薯蓣科缠绕草质藤本植物，其根茎入药称为山药，具有益气养阴、补脾益肾、固精止带等功效[4]。山药不仅作药用，亦作食用，具有较高的营养价值，是我国著名的药食同源中药材。山药在我国很多省区以栽培方式生产，以古怀庆府（今河南省焦作市温县、沁阳市、武陟县等沿沁河一带）质量最佳，其为我国道地产区[5]，习称“怀山药”。当前，针对怀山药的研究主要集中在其栽培技术、次生代谢产物以及多糖提取工艺等方面，而对其内生真菌的研究还比较薄弱。

近年来本研究组一直致力于怀山药药材品质以及内生真菌资源的开发与利用等研究。在前期研究中，通过高通量测序技术分析了怀山药中内生真菌种群分布情况[6]，明确了怀山药主要优势内生真菌的种群结构；对怀山药可培养的内生真菌进行了系统分离和鉴定[7]；对怀山药内生真菌的次生代谢产物开展了初步研究[8]，并发现一株怀山药内生镰孢属真菌能够分泌生长激素3-吲哚乙酸[9]。这些研究为探讨怀山药品质与内生真菌之间的联系以及挖掘怀山药内生真菌活性次生代谢产物提供了实验基础。

为了研究怀山药内生真菌中活性次生代谢产物，进一步开发利用怀山药内生真菌资源，本研究选取一株怀山药内生真菌Alternariasp.L12 为研究对象，对其大米发酵物乙酸乙酯萃取部位的化学成分进行研究，以期发现结构新颖的活性物质。

1 仪器与试药

Avance Ⅲ400 MHz 超导核磁共振仪（瑞士Bruker 公司）；Agilent 1100 分析型高效液相色谱 仪（美 国Agilent 公 司）；Amethyst C18-H 分析 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（美 国Sepax 公司）；Waters 1525 制备型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；ZORBAX SB-C18半制备柱（5 μm，9.4 mm×250 mm）（美国Agilent 公司）；SWCJ-2D 型双人净化工作台（上海苏京工业仪器）；GXZ 多段编程型智能培养箱（宁波江南仪器厂）；LDZX-30FBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）。

薄层硅胶板GF254（青岛鼎康硅胶有限公司）；柱层析硅胶（80 目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（美国通用）；RP-C8（日本富士）；色谱甲醇、乙腈（天津四友）；PDA、PDB 培养基（Solarbio 生物试剂有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等试剂均为分析纯（天津富宇）。

2 方法

怀山药新鲜样品采自道地产区焦作怀山药种植基地，采用PDA 培养基从怀山药中分离得到实验菌种。通过5.8S rDNA-ITS 测序技术，对比GenBank 数据库，将其鉴定为链格孢属真菌（菌株编号为Alternariasp.L12）。因该菌株鉴定到属水平，故列出其ITS 序列为TGGAACCTCTCGG GGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGT CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTT CGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTT GTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAAT AATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAAT CATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTT GGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGT CATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG GCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGC CTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTT CGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCA GCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTT CAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC CCGCTGAACTTAAGCATTCAATAAGCGGAGG AA。

2.1 菌种的活化、培养与发酵

将保存于－80℃冰箱中的菌种于常温下活化后，接种于已灭菌的PDA 培养基，置于恒温培养箱中培养5 d 备用。然后将在PDA 培养基预培养的菌种接种到PDB 培养基（200 mL）中，在恒温摇床中28 ℃、120 r·min－1条件下振荡培养5 d，得真菌发酵种子液。在600 mL 的圆形发酵瓶中，加入100 g 大米和100 mL 去离子水，于121℃高压灭菌20 min 后放冷备用。将已制备的种子液加入发酵瓶中（共20 瓶，每瓶约10 mL），在28 ℃恒温培养箱中培养28 d，即得。

2.2 真菌发酵物的提取与分离

将Alternariasp.L12 大米发酵物用甲醇浸提，每次3 d，共提取3 次，抽滤。取滤液经减压浓缩除去甲醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩除去有机溶剂得到乙酸乙酯浸膏64.97 g。乙酸乙酯浸膏经硅胶柱层析，用不同比例二氯甲烷-丙酮（1∶0、2∶1、0∶1，V/V）依次洗脱，得到3个组分（Fr.1 ～3）。Fr.1 经硅胶柱层析、Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离得到化合物3（7.4 mg）。将Fr.2 部分通过反相中压柱色谱，用20%、40%、60%、80%、100%甲醇依次洗脱，得到5 个亚组分（Fr.2.1 ～2.5）。Fr.2.1（20%甲醇洗脱部分）经硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备HPLC 分离得到化合物8（11.7 mg）；Fr.2.2 经硅胶柱层析和半制备HPLC 分离得到化合物5（25.9 mg）、6（13.9 mg）、7（20.3 mg）；Fr.2.4 经硅胶柱层析、Sephadex LH-20 凝胶柱层析和半制备HPLC 分离得到化合物1（10.1 mg）、2（9.6 mg）、4（7.4 mg）。

3 结果

化合物1：棕色油状物。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：5.35（1H，brs，H-9），4.04（1H，dd，J＝12.6，5.2 Hz，H-2），1.44（3H，s，Me-14），0.98（3H，d，J＝6.9 Hz，H-22），0.86（3H，d，J＝6.7 Hz，H-21）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：199.7（C-1），72.3（C-2），31.1（C-3），28.9（C-4），174.1（C-5），88.4（C-7），44.5（C-8），119.8（C-9），149.9（C-10），46.0（C-11），16.2（C-12），106.8（C-13），23.4（C-14），34.0（C-15），36.5（C-16），26.1（C-17），34.5（C-18），36.9（C-19），68.5（C-20），17.2（C-21），20.9（C-22）。该化合物的核磁数据与文献[10-11]报道基本一致，故鉴定为tricycloalternarene 1b（见图1）。

化合物2：白色针晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：11.84（1H，s，7-OH），10.37（1H，s，3-OH），7.24（1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），6.73（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.63（1H，d，J＝1.9 Hz，H-8），3.92（3H，s，H-12），2.74（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.9（C-1），118.1（C-2），159.0（C-3），102.1（C-4），164.6（C-7），99.6（C-8），166.6（C-9），103.9（C-10），25.5（C-11），56.3（C-12），153.1（C-4a），98.9（C-6a），138.3（C-10a），109.3（C-10b）。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定为alternariol-9-O-monomethyl ether（见图1）。

化合物3：白色无定形粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：6.53（1H，d，J＝8.5 Hz，H-7），6.26（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6），5.22（2H，dd，J＝15.2，7.6 Hz，H-22，H-23），3.77（1H，m，H-3），1.02（3H，d，J＝6.8 Hz，H-21），0.94（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.91（3H，s，H-19），0.89（3H，s，H-19），0.86（3H，overlap，H-27），0.84（3H，overlap，H-26）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：34.5（C-1），29.5（C-2），65.6（C-3），36.8（C-4），82.1（C-5），135.4（C-6），130.3（C-7），79.3（C-8），51.3（C-9），36.4（C-10），20.0（C-11），39.3（C-12），44.4（C-13），51.7（C-14），23.0（C-15），28.4（C-16），56.2（C-17），11.9（C-18），17.2（C-19），39.7（C-20），20.2（C-21），135.4（C-22），132.1（C-23），42.9（C-24），33.0（C-25），18.7（C-26），19.0（C-27），16.8（C-28）。参考文献[13]报道的波谱数据，鉴定为过氧麦角甾醇（见图1）。

化合物4：浅黄色结晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：7.26（1H，d，J＝1.6 Hz，H-10），6.72（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.64（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.38（1H，d，J＝1.6 Hz，H-8），2.71（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.3（C-1），117.5（C-2），158.4（C-3），101.5（C-4），164.0（C-6），164.3（C-7），100.8（C-8），165.4（C-9），104.3（C-10），25.2（C-11），152.6（C-4a），97.3（C-6a），138.0（C-10a），108.9（C-10b）。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定为alternariol（见图1）。

化合物5： 白色针晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.11（2H，d，J＝8.2 Hz，H-2，6），6.74（2H，d，J＝8.2 Hz，H-3，5），3.50（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：126.9（C-1），131.5（C-2，6），116.4（C-3，5），157.6（C-4），41.2（C-7），176.4（C-8）。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定为对羟基苯乙酸（见图1）。

化合物6： 白色结晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.07 ～7.14（2H，overlap，H-4，H-6），6.77 ～6.80（2H，overlap，H-3，H-5），3.60（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：123.0（C-1），156.9（C-2），116.0（C-3），129.4（C-4），120.6（C-5），132.2（C-6），36.8（C-7），176.4（C-8）。以上核磁数据与文献[16]报道的一致，故鉴定为邻羟基苯乙酸（见图1）。

化合物7： 无色结晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.23 ～7.35（5H，m，H-2，3，4，5，6），3.61（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：136.2（C-1），130.5（C-2，6），129.6（C-3，5），128.0（C-4），42.1（C-7），175.8（C-8）。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定为苯乙酸（见图1）。

化合物8：白色结晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.05（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6），6.72（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），3.70（2H，t，J＝7.1 Hz，H-8），2.73（2H，t，J＝7.1 Hz，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：131.2（C-1），131.0（C-2，6），114.7（C-3，5），156.9（C-4），39.6（C-7），64.7（C-8）。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定为对羟基苯乙醇（见图1）。

图1 化合物1 ～8 的化学结构Fig 1 Chemical structure of compound 1 ～8

4 结论与讨论

前期研究表明，怀山药含有丰富的链格孢属内生真菌。本研究首次对一株怀山药链格孢属内生真菌的次生代谢产物开展了化学成分研究，共分离得到8 个化合物，经鉴定均为已知化合物。其中化合物1 为混合萜类真菌毒素，化合物2 和4 为链格孢酚类真菌毒素，因此，在怀山药饮片安全检测中要引起重视。尤其是怀山药药材储藏期间这些真菌毒素是否存在累积效应还需要进一步研究。另有文献表明，化合物1、2 和4 还具有多种生物活性，如化合物1 对Lewis 肺癌细胞3LL 和人神经母细胞瘤SH-SY5Y 具有显著的体外细胞毒活性[19]；化合物2 和4 对 KB 和KBv200 癌细胞具有显著的细胞毒活性[20]。因此，不管是从食品安全的角度，还是从挖掘怀山药链格孢属内生真菌的活性次生代谢产物角度，该属真菌都具有继续深入研究的意义和价值。