黄芪甲苷对甲状腺功能减退雌性大鼠子宫氧化应激反应的影响

杨伟伟，李艳飞，钱素敏

(沧州市中心医院妇二科，河北 沧州 061001)

甲状腺功能减退症是常见的内分泌疾病[1]。近年来，甲状腺疾病的发生率呈逐年上升趋势，且随年龄的增长而增加。本病女性显著高发，男女发病比例为1∶(4～5)[2]。甲状腺功能减退对卵巢、子宫、胎盘及生育有不利影响[3]。黄芪甲苷(astragaloside IV，AST)为我国传统中药品种黄芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、延缓衰老、促进机体代谢和提高机体免疫力等多种药理学活性[4]。本研究通过建立甲状腺功能减退大鼠实验模型，观察AST对大鼠子宫组织氧化应激反应的影响，探讨AST干预甲状腺功能减退症对子宫的作用机制，为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

4月龄SPF级Wistar雌性大鼠[北京斯贝福生物技术有限公司，北京；实验动物生产许可证号: SCXK(京)2016-0002]。遵偱3R原则，实验过程中充分保证动物福利、给予动物人道关怀。大鼠自由饮水并饲以颗粒饲料，12 h昼夜循环，饲养温度(22±2)℃，湿度(50±5)%。

1.2 仪器

Waters 600高效液相色谱仪(Waters公司，美国)；LabTech全自动紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司，北京)；FT-1000生物张力传感器和BL420N生物电信号采集系统(成都泰盟科技有限公司，成都)；Spectra MaxM4全波长酶标仪(美国分子公司，美国)；Sigma 3K15型超速冷冻离心机(sigma公司，德国)，Milli-Q Academic超纯水器(millipore公司，美国)。

1.3 试剂

AST(纯度>98%；Aladdin公司，上海)；丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU；上海朝晖药业有限公司，上海；批准文号：H31021082)；左甲状腺素钠片(默克公司，德国；批准文号：H20140052)；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adeno-sine diphosphate，ADP)及一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP) (Amresco公司，美国)；髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)及考马斯亮蓝试剂盒(以上均为南京建成生物工程研究所，南京)。

1.4 方法

1.4.1 实验分组及造模给药 取4周龄SPF级Wistar雌性大鼠60只，体质量(110±10)g，适应性饲养1周，按体质量均衡原则，采用随机数表法抽取10只大鼠作为对照组，除对照组外，其余大鼠以10 ml/kg体积给予0.1%的PTU溶液灌胃造模，对照组给予等体积自来水灌胃，1次/d，15 d后通过检测血清三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、游离三碘甲状腺原氨酸、游离甲状腺素、促甲状腺激素水平验证模型[5]。造模成功后将大鼠随机分为5组：模型组，AST 20、40、80 mg/kg组及左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组。16 d起，除对照组外，其余各组每隔1 d按10 ml/kg给予0.1%的PTU溶液灌胃，对照组给予等体积自来水灌胃。AST各剂量组按10 ml/kg相应药物(按人的常规日剂量与体表面积折算)分别灌胃，左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组按10 ml/kg左甲状腺素钠灌胃，对照组和模型组等体积自来水灌胃，1次/d，连续给药30 d。

1.4.2 标本采集与检测 末次给药24 h后经腹主动脉取血分离血清，同时颈椎脱臼法处死大鼠，开腹取两侧子宫组织，先取血清和左侧子宫组织置于-80 ℃冰箱保存备检，右侧子宫组织置于乐氏液的培养皿中备用。

1.4.3 大鼠血清MPO、CAT活力和NO含量测定 取上述备用的血清，依据试剂盒说明分别测定大鼠血清中CAT的活力和NO的含量，并用酶联免疫吸附法检测MPO水平。

1.4.4 离体子宫平滑肌灌流记录子宫活动力 取上述备用的右侧子宫，制备子宫平滑肌条，置于恒温浴槽内，用相应的药物灌流并用BL420N生物电信号采集系统记录10 min时离体子宫平滑肌收缩张力(contraction tension, CT)、收缩频率(contraction frequency, CF)，计算离体子宫活动力(uterine motility, UM)[6]。UM=CT×CF。

1.4.5 大鼠子宫组织SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量以及Ca2+浓度检测 在离体子宫平滑肌灌流实验结束后，先取上述备用的左侧子宫组织制成匀浆，依据试剂盒说明分别测定大鼠子宫组织中SOD、GSH-Px活性，MDA、LDH含量和Ca2+浓度。

1.4.6 子宫组织中高能磷酸化合物检测 取左侧子宫组织制成匀浆，采用HPLC测定ATP、ADP、AMP含量，并计算子宫总腺嘌呤核苷酸(total adenine nucleotides，TAN)总量(TAN=ATP+ADP+AMP)。色谱条件：流动相由215 mmol/L KH2PO4与3.5%乙腈组成，三乙胺调pH值至6.1，流速0.5 ml/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃，进样量20 μl[7]。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血清中MPO、CAT活性和NO含量比较

与对照组相比，模型组大鼠血清中MPO活力显著升高、CAT活力明显降低、NO含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，AST 40、 80 mg/kg组和左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组MPO活性明显降低、CAT活性升高、NO含量显著降低(P<0.05)；与左甲状腺素钠组相比，AST 80 mg/kg组MPO、CAT活性和NO含量差异有统计学意义(P<0.05；表1)。

表1 各组大鼠血清MPO、CAT活性和NO含量比较

Table 1 Comparison of serum MPO, CAT and NO among rats of all groups

2.2 各组大鼠子宫组织中SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量比较

与对照组相比，模型组大鼠子宫组织中SOD、GSH-Px活性显著降低，MDA、LDH含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，AST 40、 80 mg/kg组和左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组大鼠SOD、GSH-Px活性显著升高，MDA、LDH含量显著降低(P<0.05)；与左甲状腺素钠组相比，AST 80 mg/kg组SOD、GSH-Px活性和MDA、LDH含量差异有统计学意义(P<0.05；表2)。

表2 各组大鼠子宫组织SOD和GSH-Px活性，MDA和LDH含量比较

Table 2 Comparison of uterine tissues SOD, GSH-Px, MDA and LDH among rats of all groups

2.3 各组大鼠子宫组织HEP水平比较

与对照组相比，模型组ATP、ADP、AMP、TAN水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；AST 40、 80 mg/kg组和左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组子宫组织中ATP、ADP、AMP和TAN均明显升高(P<0.05)；与左甲状腺素钠组相比，AST 80 mg/kg组ATP、ADP、AMP和TAN差异有统计学意义(P<0.05；表3)。

表3 各组大鼠子宫组织ATP、ADP、AMP和TAN含量比较

Table 3 Comparison of ATP, ADP, AMP and TAN in uterine tissues among rats of all groups

2.4 各组大鼠离体子宫组织Ca2+浓度比较

与对照组相比，模型组离体子宫平滑肌CT、CF和UM、Ca2+浓度均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，AST 40、80 mg/kg组和左甲状腺素钠9×10-3mg/kg组CT、CF和UM和Ca2+浓度均明显升高(P<0.05)；与左甲状腺素钠组相比，AST 80 mg/kg组CT、CF和UM和Ca2+浓度差异有统计学意义(P<0.05;表4)。

3 讨 论

甲状腺功能减退症是多种原因引起的甲状腺激素合成或分泌不足，导致机体生物效应下降的内分泌疾病，且女性患者居多，并常伴有生殖功能的改变，主要通过下丘脑-垂体-性腺轴来发挥调节机制。甲状腺功能减退可引起子宫氧化应激反应[8]，如活性氧基团产生过多[9]，自由基氧化功能与抗氧化功能失调,导致体内清除自由基的酶和非酶系统防御功能减退，如MPO、CAT、NO、MDA、SOD和GSH-Px等[10-12]。黄芪为豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，味甘性微温，为我国传统中药品种。AST为黄芪的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗自由基、提高机体免疫力等多种药理学活性。本研究发现与阳性药物左甲状腺素钠相比，AST 80 mg/kg更能提高机体抗氧化酶的活性，使子宫组织免受过脂质过氧化的破坏，减轻细胞的损伤程度，进而起到保护氧化应激损伤的作用。

甲状腺功能改变，引起能量代谢障碍[13]，脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化受阻，仅靠糖的无氧酵解来提供ATP，这样提供的ATP量很少，且效率很低。乳酸是糖酵解终产物，相应的LDH活力会升高，这一现象将引发细胞代谢紊乱和功能异常。由于ATP水平降低不能提供组织所需能量时，机体将依次降解ADP、AMP、腺苷、次黄嘌呤以提供组织所需能量，进一步造成体内ATP、ADP、AMP及TAN水平降低[14]。细胞因能量供给不足而出现代谢紊乱，并最终造成结构破坏及功能异常。因此，改善和保证高能磷酸化合物的正常代谢是纠正甲状腺功能低下引起的能量代谢障碍，维持组织器官正常功能的前提。本研究显示，AST 80 mg/kg组离体子宫平滑肌中ATP、AMP、ADP和TAN均较模型组和左甲状腺素钠组明显提高、LDH活力降低，提示AST 80 mg/kg较左甲状腺素钠具有更好地促进组织能量代谢、增强组织供能，从而改善和纠正甲状腺功能低下引起的子宫能量代谢障碍。

表4 各组大鼠子宫组织Ca2+浓度、CT、CF和UM比较

Table 4 Comparison of Ca2+, CT, CF and UM concentration in uterine tissues among rats of all groups

为进一步研究甲状腺功能减退后能量代谢障碍与UM的关系，本研究还观察了不同灌流方法对离体UM和Ca2+浓度的影响，发现AST 80 mg/kg较模型组和左甲状腺素钠组相比，离体子宫平滑肌CT、CF、UM和Ca2+浓度均明显升高，提示其可促使Ca2+通道开放并促进Ca2+内流，以增强子宫收缩力。这进一步证实AST 80 mg/kg可能通过开放Ca2+通道而增强离体子宫平滑肌的敏感性，并通过促进能量代谢而发挥对子宫的保护作用，其作用强于左甲状腺素钠。

综上，目前临床上治疗甲状腺功能减退症引起的子宫功能低下症状尚缺乏较全面有效的疗法。本研究证实，AST 80 mg/kg能有效降低甲状腺功能减退大鼠子宫氧化应激损伤的作用，且具有一定剂量依赖性，可为临床应用提供相关的实验依据，其作用机制可能与AST能有效改善抗氧化酶活性、提高机体清除自由基能力以及开放Ca2+通道、增强子宫平滑肌的敏感性、促进能量代谢有关。