人肝癌细胞97H中YAP下调对TGF-β1 mRNA的影响

2021-04-28 09:58孔亚林刘承利张洪义
空军航空医学 2021年1期
关键词:拷贝数靶向引物

王 成,孔亚林,刘承利,蒲 猛,赵 刚,张洪义

Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo通路下游的一种转录激活子[1],它所在的Hippo通路主要行使调控细胞增殖功能。YAP蛋白与人和小鼠的肝癌进展密切相关[2-3]。YAP基因在其他实体癌中[4-6]也被视为一种癌基因。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是肝细胞增殖的负性调节因子,在肝再生晚期表达增强[7]。肝癌患者外周血中TGF-β1 mRNA明显升高[8]。TGF-β1可通过激活Hippo通路来抑制YAP功能,从而抑制肝癌细胞增殖[9],2种因子在调控肝癌细胞增殖方面关系密切。目前针对YAP的靶向抑制是控制肝癌增殖的热点,但靶向治疗是否会带来相关因子的变化和新的问题需要更多的关注。本研究拟应用RNA干扰技术下调MHCC97H细胞中YAP mRNA水平,测试干扰后该细胞中TGF-β1 mRNA的变化,将有利于针对YAP基因的靶向治疗的研究。另外,前期研究发现,MHCC97H细胞的YAP mRNA高于与其同源的另一肝癌细胞MHCC97L[10]。本研究拟测试YAP mRNA水平较低的MHCC97L细胞中TGF-β1 mRNA水平,并与MHCC97H细胞内TGF-β1 mRNA水平相比较,进一步在自然存在的肝癌细胞中寻找二者相关性的有力证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞系 人肝癌细胞系MHCC97(包括97H和97L)购自上海细胞库,是裸鼠人肝癌转移模型在体外建立的(97H肺转移率为100%,97L肺转移率较低,为40%)。

1.1.2 RNA干扰序列 用于行YA P基因干扰的序列选自短发夹R N A克隆库。有效抑制靶点序列:YAP1 NM_001130145 Human,5'-CATTGCTGCTGTTAATGTA-3'。

1.1.3 PCR引物 所有引物为人源,由上海生工公司设计合成,经Primer BLAST(NCBI)验证特异性好。Y A P引物:正向链序列:5'-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3',反向链序列5'-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3',引物长度257 b p;TGF-β1引物:正向链序列5'-TTCCTGGCGATACCTCAGCAACC-3',反向链5'-CGCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3',引物长度131 bp;内参GAPDH引物:正向链序列5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3',反向链序列5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3',引物长258 bp。

1.1.4 主要试剂、仪器 培养液:高糖DMEM(Hyclone)+10%胎牛血清(Gibco),培养液加青、链霉素各100单位/ml。细胞裂解试剂:Trizol®Reagent(大连宝生物科技有限公司,中国)。逆转录试剂盒:PrimeScript®RT reagent Kit Perfect Real-Time DRR03S(大连宝生物科技有限公司,中国)。荧光定量PCR试剂盒:SYBR PremixEx Taq(Perfect Real-Time)DRR041S(大连宝生物科技有限公司,中国)。实验仪器:实时荧光定量PCR 仪(罗氏,瑞士)。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA干扰及PCR实验

1.2.1.1 慢病毒载体构建 慢病毒载体(pMagic 4.1)构建依托上海赛博医疗生物科技有限公司完成,编号:SB1262-C。慢病毒的包装、浓缩和滴度测定结果满意。

1.2.1.2 细胞培养、转染细胞 复苏冻存的97H细胞,悬浮于含10%胎牛血清高糖DMEM培养基中,培养、传代2次。将细胞分为干扰组和对照组,每组各3份细胞。转染:慢病毒溶于含聚凝胺(8 mg/ml,西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司,中国)培养基中。干扰组将含质粒的慢病毒转染97H细胞;对照组加入空载体,转染时间为72 h,之后同时提取总RNA。

1.2.1.3 RNA提取 取干扰组及对照组的97H细胞加入Trizol试剂裂解细胞,应用氯仿、异丙醇、乙醇纯化RNA。紫外吸收检测RNA的浓度和纯度。

1.2.1.4 反转录合成cDNA 反应体系配置按试剂盒(PrimeScript® RT reagent Kit Perfect Real-Time:DRR03S)操作。条件:37 ℃ 15 min(反转录)→85 ℃5 s(失活)所得产物用于下一步PCR扩增。

1.2.1.5 荧光定量PCR 反应体系按试剂盒(SYBR Premix Ex Taq Perfect Real-Time:DRR041S)配置。条件:95 ℃ 10 s→95 ℃ 5 s→60 ℃ 20 s×35 Cycles。应用LightCycler软件分析得出各个样品YAP mRNA、TGF-β1mRNA及内参的Ct值结果,共得到6组数据。

1.2.2 97H细胞与97L细胞中2种因子的mRNA水平比较(PCR实验) 复苏冻存的97H和97L细胞,每种细胞各3份,至对数生长期后同时行RNA提取、反转录合成cDNA、荧光定量PCR,方法、试剂、条件同前面实验,测试2种细胞中YAP mRNA、TGF-β1mRNA及内参的量。应用LightCycler软件分析得出各个样品Ct值结果,共得到6组数据。

1.3 统计学处理 采用2--△△Ct法[11],比较RNA干扰前后97H细胞中2种因子的mRNA量的变化。应用直接比较Ct值的方法,比较2种细胞中2种因子的mRNA量的差别。干扰因素少按内参GAPDH的Ct值行数据加权,应用Excel 2003对PCR结果行配对比较,并制作图表,Ct值越低,mRNA水平越高,1个Ct值约相当于2倍核酸拷贝数之差。

2 结果

2.1 MHCC97H细胞YAP mRNA和TGF-β1 mRNA变化 对YAP基因行RNA干扰后97H细胞内的YAP mRNA总量较对照组减少,伴随TGF-β1 mRNA量升高。干扰组和对照组细胞分别受干扰试剂及对照试剂作用72 h后,细胞内的YAP mRNA和TGF-β1 mRNA同时发生变化,干扰组YAP mRNA拷贝数降低到对照组的48.3%(表1),同时TGF-β1 mRNA拷贝数升高到对照组的1.2倍(表2),变化明显。

表1 MHCC97H细胞干扰组和对照组的YAP mRNA变化

表2 MHCC97H细胞干扰组和对照组的TGF-β1 mRNA变化

2.2 97H与97L细胞中TGF-β1 mRNA和YAP mRNA水平 YAP mRNA水平较低的97L细胞中TGF-β1 mRNA水平较高。在内参GAPDH 的Ct相等的情况下,在同一种细胞97H细胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA,二者相差0.39个Ct值。在同一种细胞97L中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA,二者相差0.52个Ct值(图1)。按内参GAPDH的Ct值行数据加权后,比较2种细胞后发现:97L细胞的YAP mRNA水平低于97H。同时,97L细胞的TGF-β1mRNA水平高于97H(图1)。可见,自然存在的人肝癌97系列细胞中如YAP mRNA水平较低的细胞TGF-β1 mRNA水平较高。

图1 2种细胞(97H、97L)中的2种因子mRNA的PCR反应结果

3 讨论

肝细胞癌中的YAP蛋白被认为是影响病人无瘤生存期和总生存期的独立危险因素[12]。针对YAP基因的靶向治疗可能成为肝癌治疗的重要方法。在前期研究中发现在人肝癌细胞MHCC97H中针对YAP基因的RNA干扰作用能够抑制YAP蛋白表达,并抑制癌细胞增殖[10],本研究所用干扰序列及方法与前期研究[10]相同。针对某一种靶基因的治疗是否会影响其他相关基因和蛋白的表达是靶向治疗需要特别关注的问题。作为主要功能为抑制肝细胞增殖并在肝癌组织中呈高表达的TGF-β1是针对YAP的靶向治疗需首先关注的基因,它与YAP基因的关系及在靶向治疗中的变化会影响靶向治疗的效果。

在人的正常肝脏中TGF-β1 mRNA和蛋白一般无明显表达[13],只有在肝发生纤维化或硬化时,间质细胞可表达TGF-β1 mRNA。然而已有研究证明肝细胞癌的细胞内有相对较高的TGF-β1表达[14]。

本研究中,当人肝癌细胞MHCC97H的YAP mRNA受RNA干扰作用而下调后,TGF-β1 mRNA水平出现同步升高。当干扰组YAP mRNA拷贝数降低到对照组的48.3%,TGF-β1 mRNA拷贝数升高到对照组的1.2倍。这提示YAP基因和或蛋白变化会影响内源性TGF-β1 mRNA水平,目前尚不知这种变化是否有利于实现抑制肝癌细胞增殖的最初目的。

另外,前期研究[10]证明97L细胞的YAP mRNA水平低于97H,并且其增殖力也低于97H,这是一种天然的水平比较,测试该细胞的TGF-β1 mRNA的水平可以回答天然存在的YAP mRNA水平下降是否伴随TGF-β1 mRNA升高。因97H和97L是人肝癌细胞MHCC97的2种不同亚型细胞,从共同的细胞起源分离而来,具有同源性,不易受外因影响,两者的比较更加科学。并且在同一细胞中行2种核酸的相对定量比较可减少误差,较为科学,结果可信度大。

实验中发现,97L细胞中YAP mRNA水平低于97H,而97L的TGF-β1 mRNA的确高于97H。不仅如此,还发现YAP mRNA和TGF-β1 mRNA在2种细胞中出现“此消彼长”的现象,即在97H细胞中YAP mRNA水平高于TGF-β1 mRNA;在97L细胞中YAP mRNA水平低于TGF-β1 mRNA。

假设从97H细胞到97L细胞存在一个细胞演变过程,此过程中YAP mRNA水平下降,同时伴随TGF-β1 mRNA水平升高,这种态势与前述的YAP mRNA受干扰后的二者的变化结果非常相似。综合基因干扰实验及自然存在的2种亚型肝癌细胞的对比研究后,可以认为:在肝癌细胞中YAP的下调对内源性TGF-β1 mRNA有明显的上调作用。虽然早先已有研究提示,YAP可抑制TGF-Smad通路功能[15],但YAP对肝癌细胞内源性TGF-β1 mRNA的影响尚未见报道,结合本实验结果推测YAP做为核转录因子有可能参与调控肝癌细胞自身的TGF-β1 mRNA的量,并起到抑制作用,即高水平YAP存在时TGF-β1 mRNA水平受抑制,当YAP水平下降时,TGF-β1 mRNA水平升高。这一结果对针对YAP基因的靶向治疗研究有重要意义。

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