焦性没食子酸联合唑类药物对念珠菌的抑菌作用

张冠怡 姚冬婷 胡晓波

(上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海200030)

中国临床感染性疾病调查研究显示，在非白念珠菌中，光滑念珠菌(Candidaglabrata)成为第二大引起侵袭性真菌感染疾病的病原体[1]。在临床治疗中，光滑念珠菌对唑类药物具有天然抗药的特点，特别是对氟康唑具有迅速产生抗药的趋势[2]。近年来，随着抗真菌药物长期和广泛使用，临床治疗中光滑念珠菌耐药问题日趋严重，了解临床菌株的耐药情况和寻求新的治疗途径具有重要临床意义。

中药治疗真菌感染具有不良反应少、激发形成耐药低和预后良好等优点。众多研究表明，中药对念珠菌具有一定抑菌作用，如五倍子[3,4]。中西医结合治疗标本兼顾，可以减少唑类药物的不良反应、提高患者的免疫力以及改善预后[5]。焦性没食子酸(邻苯三酚)是一种多酚类化合物，可在芡实、月季等中药材中提取得到[6]。研究表明不同浓度的焦性没食子酸对白念珠菌、金色葡萄球菌、大肠杆菌等均具有抑菌作用[7]。

本实验研究目的在于了解临床分离的光滑念珠菌的药敏情况，便于更好的指导临床用药。运用氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑三种唑类药物联合焦性没食子酸作用于临床分离的光滑念珠菌，观察焦性没食子酸联合唑类药物对光滑念珠菌的抑菌作用，以改善光滑念珠菌临床耐药以及预后情况。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株来源 从上海仁济医院、上海东方医院和上海龙华医院共收集光滑念珠菌116株，质控菌株为ATCC90030，另从上海龙华医院收集临床白念珠菌49株、热带念珠菌42株、克柔念珠菌4株、近平滑念珠菌13株。所有菌株均由飞行质谱仪(布鲁克)鉴定到种。

药物 唑类药物氟康唑(fluconazole，FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)购于东方生物公司、伏立康唑(voriconazole，VRC)(汇德利康)购于龙华医院、焦性没食子酸(pyrogallic acid)购于上海友丝有限公司。

试剂 DMSO购于BIOSHARP生物公司、MOPS购于生工生物工程有限公司、RPMI1640培养基购于埃乐生物公司。

1.2 方法

药物敏感性试验 按照ATB FUNGUS3药敏试条(法国梅里埃)说明操作，培养24 h和48 h，通过肉眼判读观察其生长情况，记录菌株的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值。根据2017年CLSI M60指南判断光滑念珠菌对氟康唑的敏感性，MIC≤32 μg/mL为剂量依赖性敏感(susceptible does-dependent,SDD)，MIC≥64 μg/mL为耐药(resistant,R)[8]，采用ECVs(epidemiologicalcutoff values)判断伏立康唑和伊曲康唑的敏感性，分别为MIC<0.25 μg/mL和MIC<4 μg/mL为野生菌株(wild-type,WT)，MIC≥0.25 μg/mL和MIC≥4 μg/mL为非野生菌株(non wild-Type，non-WT)(Clinical and Laboratory Standards Institute [CLSI], 2018)。

药剂配制 ①RPMI肉汤：称取34.53 gMOPS、10.4 gRPMI粉剂,加入900 mL无菌蒸馏水，定容至1 L，过滤器过滤除菌，4℃保存备用。②焦性没食子酸：100 mg焦性没食子酸粉末加入1000 μL DMSO，取128 μL储存液加入至50 mL RPMI肉汤中摇匀，倍比稀释得到浓度为128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL。③氟康唑配制：100 mg氟康唑粉末中加入20 mL无菌蒸馏水，取2048 μL的氟康唑储存液和7952 μL的RPMI肉汤，混匀，倍比稀释得到浓度为512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL。④伊曲康唑配制：100 mg伊曲康唑粉末中加入2 mLDMSO加热至完全溶解，取64 μL伊曲康唑储备液加入50 mL无菌蒸馏水中加热，倍比稀释得到浓度为32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.0625 μg/mL。⑤伏立康唑配制：100 mg伏立康唑用5 mL专用溶媒(乙醇、丙二醇各2.5 mL)溶解，后用生理盐水稀释至2000 μg/mL，50 mL试管中加入46.8 mL无菌蒸馏水和3.2 mL的储备液，混匀，得到浓度为128 μg/mL的伏立康唑，倍比稀释得到浓度为64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL。

菌悬液的配制 配置0.5麦氏度的菌悬液[细胞浓度(1～5)×106CFU/mL]。取3个离心管，编号1～3，分别加入900 μL、900 μL的生理盐水和9 mL的RPMI肉汤，取100 μL的0.5麦氏度的菌悬液至第1个离心管中，得到1∶10稀释菌悬液，从第1个管中取100 μL至第2个离心管，得到1∶100的稀释菌悬液，将第2个离心管的1 mL菌悬液移入9 mL的RPMI肉汤中，得到1∶1000稀释菌悬液[细胞浓度(1～5)×103CFU/mL]。

棋盘肉汤稀释法 在96孔板的A～H行中依次加倍比稀释的焦性没食子酸和RPMI肉汤，1～12列中分别加入倍比稀释的唑类药物和RPMI肉汤，H12为生长对照孔。根据部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index FICI)判断相互作用，FICI≤0.5协同作用、0.54拮抗作用，FICI指数=联合时甲药的MIC/甲药的MIC+联合时乙药的MIC/乙药的MIC[13]。

统计学方法 通过SPSS 24.0软件计算，运用非参数秩和检验方法，P<0.05认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 药敏试验结果

根据CLSI M60推荐的念珠菌属参考范围，临床分离的116株光滑念珠菌对氟胞嘧啶和两性霉素B均表现为敏感，对FLC的耐药率为14.66%(17株)，22.41%(26株)菌株为ITR非野生型，81.03%(94株)菌株为VRC非野生型，同时表现FLC耐药以及ITR和VRC均为非野生型的光滑念珠菌12.93%(15株)。

2.2 焦性没食子酸单独用药时对5种念珠菌的抑菌效果

116株光滑念珠菌中，MIC50为32 μg/mL；49株白念珠菌中，MIC50为64 μg/mL；42株热带念珠菌中，MIC50为64 μg/mL；4株克柔念珠菌中，MIC50为32 μg/mL；13株近平滑念珠菌中，MIC50为64 μg/mL(见表1)。光滑念珠菌、热带念珠菌和白念珠菌三者之间的抑菌效果差异具有统计学意义(χ2=43.692,P<0.05)。

表1 焦性没食子酸单独用药时对5种念珠菌的抑菌效果

2.3 焦性没食子酸单独用药时对光滑念珠菌的抑菌效果

116株光滑念珠菌分为3组，对三种唑类药物均表现为敏感的为全敏感组(22株)，单一唑类耐药的为单一耐药组(66株)，对两种以上的唑类药物耐药的为交叉耐药组(28株)(见表2)。全敏感组与单一耐药组之间以及全敏感组与交叉耐药组之间具有统计学差异(Z=-2.706,P<0.05)，单一耐药组与交叉耐药组之间无统计学差异(Z=-0.953,P>0.05)。

2.4 焦性没食子酸联合唑类药物对念珠菌的抑菌效果

焦性没食子酸与唑类药物联合用药实验中，检测焦性没食子酸联合FLC和ITR药物对9株白念珠菌、19株热带念珠菌、1株克柔念珠菌和3株近平滑念珠菌的抑菌效果，发现FICI为1～8，抑菌

表2 焦性没食子酸单独用药时对光滑念珠菌的抑菌效果

效果均表现为无关或拮抗作用。同时检测了焦性没食子酸联合FLC、ITR和VRC对116株光滑念珠菌的抑菌情况，其中，联合FLC时，对41.38%(48株)的光滑念珠菌具有协同作用，对58.62%(68株)的光滑念珠菌具有加强作用；联合ITR时，对37.93%(44株)的光滑念珠菌具有协同作用，对61.21%(71株)的光滑念珠菌具有加强作用；联合VRC时，对50%(58株)的光滑念珠菌具有协同作用，对49.71%(57株)的光滑念珠菌具有加强作用。焦性没食子酸联合ITR和VRC对光滑念珠菌的抑菌作用中分别有1例表现为无关作用(FICI=1.25)，其对ITR和VRC均表现为非野生型菌株。不同唑类药物联合焦性没食子酸对光滑念珠菌的抑菌作用之间差异无统计学意义(χ2=3.505，P>0.05)。

焦性没食子酸与FLC联合用药时，81.03%(94株)的光滑念珠菌降低的唑类MIC值为2～3个浓度梯度，最高降低6个浓度梯度。与ITR联合用药时，68.1%(79株)菌株的MIC值降低的浓度梯度为2～3个浓度梯度，降低最高为4个浓度梯度。与VRC联合用药时，77.59%(90株)的光滑念珠菌降低的唑类MIC值为2～3个浓度梯度，最高为5个浓度梯度(见表3)。联合用药时FLC剂量依赖性敏感菌株(SDD)和耐药株(R)氟康唑MIC值降低的梯度，差异具有统计学意义(Z=-4.226,P<0.01)；ITR和VRC的WT和non-WT之间差异性也具有统计学意义(Z=-4.698,P<0.05;Z=-5.023,P<0.05)，表明联合用药时对耐药菌株和非野生菌株的抑菌效果更好。

3 讨 论

光滑念珠菌作为临床侵袭性真菌感染的主要病原菌之一，其高死亡率和高耐药率已发展成为1个全球的问题，在欧洲和北美地区，光滑念珠菌已成为第2常见的血液感染病原体[9]。其血流感染的死亡率占50%[10]，常在免疫低下的患者中检出，且大部分为深部感染，对于导管插管的患者和长期使用抗生素的患者感染机会增加[11]。光滑念珠菌对临床治疗药物的耐药率也在逐年增加，唑类药物作为临床治疗念珠菌感染的常用药物，具有迅速获得耐药的特点，光滑念珠菌对两性霉素B和氟胞嘧啶均具有较高的敏感性，但其长期使用具有一定的肝损伤和肾损伤，不建议使用[12]，所以唑类药物仍然作为临床治疗念珠菌感染的首选药物。

表3 焦性没食子酸对唑类药物MIC值的影响

本研究中，光滑念珠菌对唑类药物出现不同程度的耐药现象，特别是在伏立康唑的药敏实验中81.03%的菌株表现为非野生型菌株。这些非野生型菌株对氟康唑和伊曲康唑也具有一定的耐药现象，其中有17株存在交叉耐药的现象，15株耐氟康唑的菌株，对伏立康唑和伊曲康唑表现为非野生型。

中药在治疗念珠菌感染的方面具有一定的疗效，与唑类联合用药协同作用增加疗效，缩短疗程，同时提高患者免疫力，改善复发的情况[13]。与焦性没食子酸相比，没食子酸来源和药理活性较广泛[14]，可通过破坏细菌的细胞膜达到抑菌效果，但其药物毒副作用尚不明确[15]，且在前期研究中发现没食子酸对光滑念珠菌不具有抑菌作用。焦性没食子酸可由没食子酸脱羧得到，比后者少了一个羧基[16]。研究表明焦性没食子酸在抗菌作用方面要强于没食子酸[17],其羟基可以增加抗菌活性[18]。本研究发现焦性没食子酸对光滑念珠菌的抑菌作用和热带念珠菌以及白念珠菌相比具有一定的差异性，对光滑念珠菌的抑菌效果更加显著。进一步统计分析发现，焦性没食子酸对光滑念珠菌全敏感组与单一耐药组以及全敏感组与交叉耐药组的抑菌效果之间也具有一定的差异性，对全敏感组的抑菌效果更加显著。

本研究中联合用药实验结果显示，焦性没食子酸联合唑类药物对光滑念珠菌表现为协同和相加作用，对其他念珠菌菌株的作用均表现为无关或拮抗作用。三组唑类药物与焦性没食子酸联合用药对光滑念珠菌的抑菌作用之间无差异性。联合用药显著降低了唑类药物的MIC值，非敏感组唑类药物MIC值的降低程度均高于敏感组，表明焦性没食子酸联合唑类药物对非敏感组的抑菌效果更加显著，可以有效的降低唑类药物的MIC值，同时改善非敏感菌株的抑菌情况。

光滑念珠菌的耐药机制包括生物膜的形成、药物的外排作用、线粒体的功能性缺失等，其中药物的外排作用成为光滑念珠菌耐药的主要机制[19]。外排基因包括PDR1、CDR1、CDR2等，PDR1、CDR1、CDR2基因的表达上调使得细胞内的药物排出，细胞内药物浓度的降低从而形成了耐药，焦性没食子酸是否通过影响PDR1、CDR1、CDR2等基因来降低唑类药物的耐药性有待进一步研究。Wang等[20]运用从大黄当中提取的巴马汀联合氟康唑和伊曲康唑对光滑念珠菌进行抑菌试验，其抑菌机制是CDR1、CDR2等相关外排基因的表达下调，从而使得联合用药达到其抑菌效果。Moraes等[21]从毛刺钩藤中提取出不溶性部分与氟康唑联合用药进行光滑念珠菌体外抑菌试验，发现两者之间具有协同作用，其抑菌机制为联合药物破坏了光滑念珠菌细胞壁的结构，从而达到抑菌作用。

综上所述，光滑念珠菌对唑类药物具有较高的耐药率，焦性没食子酸联合唑类药物可有效地抑制光滑念珠菌的生长，并且非敏感组比敏感组的效果更加显著，对其他4种念珠菌，联合用药时表现为无关作用和拮抗作用，焦性没食子酸联合唑类药物可作为临床治疗光滑念珠菌感染的新途径。