大鼠激素性股骨头坏死模型的建立和评价

黄立毅 赵友

激素性股骨头坏死是骨科常见的非创伤性骨坏死疾病，临床普遍认为其病因主要为大剂量外源性激素的使用，造成骨坏死并发症发生［1］。近年来，随着糖皮质激素广泛应用于自身免疫性疾病的治疗中，激素性股骨头坏死的发病率也呈逐年上升趋势［2］。但其发病机制尚不明确，建立科学有效的激素性股骨头坏死动物模型，对其病理研究具有重要意义［3］。目前激素性股骨头坏死动物模型种类较多，而其建模方式及评价方法尚未统一［4］。本研究拟通过注射脂多糖及大剂量甲基强的松建立大鼠激素性股骨头坏死模型，并进行组织形态学观察，分析其有效性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 选择清洁级SD大鼠50只，雌雄各半，均由浙江中医药大学动物实验中心提供，按照标准饲养条件在浙江中医药大学动物实验中心饲养，温度22℃～26℃，湿度37%～42%，光照按12 h昼夜交替，自由摄食饮水，每笼2只，适应性喂养1周。后按随机数表法将大鼠均分为实验组和对照组各25只，两组大鼠年龄均为12周；体重400～450 g，平均（421.64±10.54）g。

1.2 主要仪器、试剂及方法 光学显微镜（上海巴拓科技，型号：BMM-230BD DIC）；脂多糖注射液（国药准字S12020001，天津市生物化学制药厂）、甲基强的松（国药准字H20130303，天津金耀药业有限公司）、氯化钠注射液（国药准字H20044024，北京天坛生物制品股份有限公司）；睾酮（T）、促甲状腺激素（TSH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）试剂盒均购自合肥莱尔生物科技有限公司，环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）试剂盒均购自上海纪宁生物科技有限公司。实验组给予脂多糖（20 μg/kg）腹腔注射，每间隔24 h注射1次，共注射2次；肌肉注射大剂量甲基强的松（40 mg/kg），每间隔24 h注射1次，共注射3次。对照组同时间给予等量生理盐水注射。共观察6周后处死。

1.3 观察指标 （1）比较两组大鼠活动情况。在进行6周的行为学观察后进行相关行为学试验，评估大鼠活动情况，开场试验：准备内壁为黑色的试验箱，底面用白线划分为面积相等的25块正方形，将大鼠置于中心方格内，记录大鼠活动的平均速度和活动总距离；自主活动次数测定：将大鼠置于自主活动仪上，预适应10 min后，记录大鼠3 min内自主活动次数；抓力测试：抓持大鼠尾根处，待大鼠用力抓住抓力板时及时向后加力，测得最大抓力，测定3次/只，取平均值记录；（2）比较两组大鼠生化指标。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，后心脏穿刺抽取动脉血12 ml，分别加入含有肝素的抗凝管和不含肝素的试管，于37℃恒温水浴30 min后，以3200 r/min离心5 min，分别提取血浆和上清液保存于-20 ℃冰箱待检。采用放射免疫法检测血清T、TSH、ACTH及cAMP、cGMP水平；（3）组织病理学观察。观察6周后处死大鼠，沿大鼠股骨头冠状面剖开，尽量剔除股骨头周围软组织，后置入10%中性甲醛固定液，固定24 h，采用30%甲酸脱钙3 d后，流水冲净，后常规行脱水、透明处理、石蜡包埋，制成厚约3～4 μm的切片，经HE染色，光学显微镜下观察两组大鼠组织形态学变化情况，并采用显微镜图像分析软件测量骨小梁宽度、股骨头单位面积内骨小梁面积占比、每视野下骨空泡陷窝数量及单位面积骨小梁内胶原含量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件。计量资料以（±s）表示，组间比较行t检验；计数资料以（%）表示，组间比较行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠活动情况比较 实验组大鼠开场试验中活动平均速度、活动总距离及3 min内自主活动次数、最大抓力均低于对照组（P＜0.05），见表1。

表1 两组治疗疗效比较（±s）

活动总距离（cm）组别 n 活动平均速度（cm/s）3 min内自主活动次数（次）最大抓力（N）实验组 25 34.56±12.41 1523.46±451.34 48.64±12.42 610.54±42.12对照组 25 50.46±14.13 2041.46±641.51 63.54±13.74 731.12±39.46 t值 4.227 3.302 4.022 10.446 P值 ＜0.001 0.002 ＜0.001 ＜0.001

2.2 两组大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比较 实验组大鼠T、TSH、ACTH、cAMP水平均低于对照组（P＜0.05），cGMP水平高于对照组（P＜0.05），见表2。

表2 两组大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比较（±s）

表2 两组大鼠T、TSH、ACTH、cAMP、cGMP水平比较（±s）

组别 n T（ng/ml）TSH（ng/ml）ACTH（pg/ml）cAMP（nmol/l）cGMP（nmol/l）实验组 25 7.56±1.68 2.82±0.69 17.24±4.03 112.05±11.46 28.46±4.13对照组 25 11.42±2.05 3.54±0.67 44.81±11.06 161.02±20.41 17.42±3.05 t值 7.282 3.743 11.711 10.460 10.752 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 两组大鼠股骨头骨小梁宽度、骨小梁面积占比、空泡陷窝数量、骨小梁内胶原含量比较 实验组大鼠骨小梁宽度、股骨头单位面积内骨小梁面积占比、骨小梁内胶原含量均低于对照组（P＜0.05），空泡陷窝数量高于对照组（P＜0.05），见表3。

表3 两组大鼠股骨头骨小梁宽度、骨小梁面积占比、空泡陷窝数量、骨小梁内胶原含量比较（±s）

表3 两组大鼠股骨头骨小梁宽度、骨小梁面积占比、空泡陷窝数量、骨小梁内胶原含量比较（±s）

骨小梁内胶原含量（%）实验组 25 63.15±8.46 55.16±6.12 6.15±1.05 47.86±3.45对照组 25 93.16±8.54 68.97±6.15 0.63±0.41 55.15±6.12 t值 12.482 7.959 22.540 5.188 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001组别 n 骨小梁宽度（μm）骨小梁面积占比（%）空泡陷窝数量（个）

2.4 两组大鼠股骨头病理组织观察 观察组中股骨头部骨小梁变细，间距增大，结构紊乱，可见部分骨小梁断裂，骨髓中脂肪细胞增多，空泡陷窝数量较多；对照组中骨小梁较粗，排列规则，骨髓腔中造血细胞较多，无明显空泡陷窝（见图1～2）。

图1 观察组大鼠股骨头病理组织图

图2 对照组大鼠股骨头病理组织图

3 讨论

调查显示，激素性股骨头坏死约占股骨头坏死的3%～38%，是继外伤后造成股骨头坏死的第二大原因［5］。而长期、大量使用激素是造成激素性股骨头坏死的首要原因，疾病常引起患者疼痛、活动障碍，目前对其尚无特效治疗方案［6］。但其发病机制目前尚不明确，建立科学有效的动物模型对疾病研究具有重要意义，以往常用鸡、兔建立激素性股骨头坏死动物模型，而研究显示其方便性、适合性等稍欠缺［7-8］。

本研究显示，实验组大鼠开场试验中活动平均速度、活动总距离及3 min内自主活动次数、最大抓力均低于对照组，提示造模使用的脂多糖及大剂量甲基强的松对大鼠活动能力造成一定损害。开场试验是较为经典的大鼠行为学测试方法，可有效反映大鼠的活动能力［9］。LI等［10］研究也显示，应用激素后大鼠活动总距离和活动平均速度与正常大鼠比较差异有统计学意义。激素性股骨头坏死可引起自主活动抑制、肢力减弱等现象，与临床激素性股骨头坏死患者所表现的主动性活动减少、生活被动等类似，实验组大鼠自主活动次数减少、抓力减小提示出现激素性股骨头坏死行为学改变。

实验室相关指标可反映疾病生理或病理的变化，研究显示，激素性股骨头坏死患者垂体ACTH细胞内质网扩张，线粒体空化，ACTH合成分泌受抑［11］。T是雄性动物体内最重要的一种雄激索，在促进精子发育、维持第二性征等方面起重要作用，临床研究提示激素性股骨头坏死患者存在严重的性激索紊乱，主要表现为T含量降低［12-13］。本研究显示，实验组大鼠T、TSH、ACTH、cAMP水平均低于对照组，而cGMP水平高于对照组，与汪轩等［14］报道相似。表明注射脂多糖及大剂量甲基强的松诱导的大鼠模型可出现与激素性股骨头坏死患者相似的生化指标改变。

股骨头坏死是指股骨头内的活性成份，如骨细胞、骨髓造血细胞及脂肪细胞减少所引起的病理过程，在股骨头内出现不同程度的骨小梁及骨髓组织坏死，是股骨头坏死的本质待征［15］。骨小梁坏死在病理学上表现为骨小梁的骨陷窝内原有的骨细胞消失，形成空泡陷窝［16］。王继涛等［17］根据股骨头坏死的病理演变过程，将骨坏死的组织学特征归纳为骨髓造血成分消失；骨髓脂肪呈网状坏死；骨髓及骨小梁坏死；坏死骨髓及骨小梁周围，有纤维组织或新骨形成。本研究中，病理学观察显示实验组大鼠出现骨小梁宽度、股骨头单位面积内骨小梁面积占比、骨小梁内胶原含量降低，空泡陷窝数量明显上升，提示大鼠模型出现典型的股骨头坏死病理学征象，激素诱导的股骨头坏死模型构建成功。

综上，采用注射脂多糖及大剂量甲基强的松诱导的大鼠激素性股骨头坏死模型可形成与激素性股骨头坏死患者相似的行为学、生化指标及生理学改变，是研究激素性股骨头坏死的良好动物模型。