MaFGF对慢性脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能保护的机制研究

李燕 陈克龙 张妤婷 支海鸯 黎斌 孙慧静 陈 凌*

缺血性脑卒中是最常见的一种具有较高的致残率、致死率和复发率的脑血管疾病，且发病率逐年上升，呈年轻化趋势［1］。及时恢复缺血区的血供以保护缺血半暗带神经元是治疗关键，但脑缺血后血管再通，可导致缺血再灌注损伤，引起缺血及其周围神经细胞坏死和凋亡，加重脑缺血损伤。改构型酸性成纤维细胞生长因子（MaFGF）是一种多功效的生长刺激因子，具有调节神经、舒张血管、保护神经等多种生物学效应［2］。目前研究已证实MaFGF具有良好的抗脑缺血再灌注损伤作用［3］，但其对慢性脑缺血损伤神经保护的作用机制尚不明确。本研究通过观察MaFGF对慢性脑缺血再灌注损伤小鼠PI3K/AKT信号通路及内质网应激凋亡通路相关蛋白的影响，探讨MaFGF的神经保护功能及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 2～3月龄雄性C57BL/6J小鼠，体重22～25 g，购自上海斯莱克动物实验中心，动物许可证号为SCXK（沪）2012-0002。MaFGF（暨南大学生物工程研究所），PI3K抗体（abcam，ab86714）、p-PI3K抗体（abcam，ab182651）、p-AKT抗体（abcam，ab38449）、AKT抗体（abcam，ab8805）、caspase-12抗体（abcam，ab62484）、CHOP抗体（abcam，ab11419）、GRP170抗体（abcam，ab241049），山羊抗小鼠IgG/TRITC（中杉金桥公司，货号ZF-0313）红光二抗、山羊抗小鼠IgG/FITC（中杉金桥公司，ZF-0312）绿光二抗，Morris水迷宫（上海吉量软件科技公司），化学发光凝胶成像系统（北京东胜创新生物科技公司），荧光显微镜成像系统（OLYMPUS公司，DP72）。

1.2 建模与分组 24只雄性C57BL/6J小鼠饲养于SPF级动物房（室温22±2℃，湿度50±5%）。按照随机数字法将实验小鼠分为Sham组、BCAO组和BCAO+MaFGF组，每组各8只。双侧颈动脉夹闭获得脑缺血再灌注损伤模型：麻醉小鼠（10%水合氯醛），以仰卧姿势固定于手术台上，置于加热毯上保持直肠温度为37℃左右，同时保持呼吸顺畅，在颈部腹侧中线处常规消毒后做1 cm左右的切口，钝性分离双侧颈总动脉，夹闭双侧颈总动脉约30 min，去除动脉夹恢复灌注，缝合切口；Sham组仅切开皮肤；再灌注后，BCAO+MaFGF组开始鼻内给药20 μg/kg MaFGF，其余2组给予等体积的生理盐水，1次/d，连续28 d。

1.3 神经功能评估 分别于术前/术后第28天，采用神经功能缺损评分（mNSS）评估所有实验小鼠的神经功能损害程度，包括运动、感觉、反射、平衡试验四个方面，分值为0～18分，小鼠无神经功能损伤体征则评为0分。

1.4 水迷宫测试 （1）定位航行试验：所有小鼠在给药结束后开始训练，将平台固定于目标象限的中央，圆池中注入清水（高出平台约2～3 cm），在4个象限各取一点作为入水口并依次放入小鼠。记录60 s内小鼠的运动轨迹及逃避潜伏期（从入水到爬上平台的时间，上限为60 s）。每天在同一时间训练小鼠，连续训练5 d。（2）空间探索试验：在训练第6天，移除平台，从4个相同入水点依次放入小鼠，观察并记录60 s内小鼠的运动轨迹及穿越原平台位置次数，分析计算平均速度及在目标象限停留的时间百分比。

1.5 样本采集与保存 取0.9%氯化钠溶液心脏灌注排出脑组织血液，快速断头，取出全脑组织，放入液氮中速冻，用于后续蛋白测定及制备冰冻切片。部分小鼠继以4%多聚甲醛心脏灌注直至小鼠全身僵硬，取出大脑浸入4%多聚甲醛液中固定，进行石蜡包埋，切片，低温保存备用。

1.6 Nissl染色 取石蜡切片（片厚4 μm）进行常规脱蜡、水化、洗涤，加入甲苯胺蓝溶液染色（60 ℃，40 min），随后进行脱水（梯度乙醇）、透明（二甲苯溶液）、封片（透明树脂），光学显微镜下观察各种小鼠海马CA1区神经元形态学变化。

1.7 免疫荧光染色 液氮速冻脑组织，切片机切片，片厚8 μm，35 ℃烘箱复温5 min，4%多聚甲醛固定10 min，封闭液孵育30 min；将p-AKT、GRP170一抗稀释液（1：100）混合后覆盖各标本，置于湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次；荧光二抗室温下避光孵育1 h，PBS洗涤；最后DAPI孵育5 min，PBS洗涤，抗荧光猝灭剂封片；荧光显微镜下，随机选取5个视野，观察各组小鼠大脑海马CA1区神经元p-AKT及GRP170的表达及位置情况，并拍照。所有步骤均在黑暗中进行。

1.8 Western blot RIPA组织裂解液裂解海马组织细胞，提取总蛋白，使用BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，制备蛋白样品。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将各组蛋白样品中不同分子大小的蛋白分离并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，转膜完成后脱脂奶粉室温封闭1 h。随后一抗稀释液4 ℃孵育过夜，滴加二抗稀释液室温孵育2 h，最后条带滴加ECL化学曝光液，通过Bio-rad曝光机显色曝光，采用ImageJ分析各蛋白灰度值，比较各组小鼠大脑海马区p-PI3K、p-AKT、caspase-12、CHOP、GRP170的蛋白表达水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组之间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠的mNSS评分比较 各组小鼠术前mNSS评分均为0分，表明术前各组小鼠的神经功能均正常；术后Sham组小鼠评分为0分，BCAO组小鼠mNSS评分与Sham组比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；给予MaFGF治疗后，BCAO+MaFGF组小鼠mNSS评分明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 各组小鼠认知行为能力比较 在定位航行试验中，随着训练次数的增加，各组小鼠的逃避潜伏期逐渐降低。在训练第3天，与Sham组比较，BCAO组小鼠逃避潜伏期明显下降（P＜0.05）；与BCAO组比较，MaFGF组小鼠逃避潜伏期均明显缩短（P＜0.05）。在空间探索试验中，BCAO组小鼠平均穿越平台次数与Sham组比较明显减少（P＜0.05）；MaFGF组平均穿越平台次数及60 s内在原平台象限停留的时间百分比与BCAO组比较明显增加（P＜0.05）。见图2。

图1 术后各组小鼠mNSS评分结果。与Sham组比较，★P＜0.05；与BCAO组比较，# P＜0.05

图2 A 各组小鼠在定位航行试验中训练第5天的运动轨迹；B 各组小鼠在空间探索实验中穿越平台的运动轨迹；C 各组小鼠逃避潜伏期变化趋势及空间探索实验结果，包含平均速度（cm/s）、穿越平台次数（times）和目标象限时间（s）；与Sham组比较，★ P＜0.05；与BCAO组比较，# P＜0.05

2.3 各组小鼠海马CA1区神经元细胞形态结构的变化 Nissl染色显示，Sham组小鼠海马CA1区神经元细胞呈圆形或锥体形，细胞排列整齐，细胞核饱满，核仁明显，胞浆呈深蓝色，内含丰富的尼氏体；与Sham组比较，BCAO组小鼠海马CA1区神经元细胞排列紊乱、疏松，可见大量细胞结构破坏，细胞核固缩、碎裂，坏死细胞数目明显增多（P＜0.05）；与BCAO组比较，BCAO+MaFGF组小鼠海马CA1区正常神经元细胞增多，坏死细胞数目明显减少（P＜0.05）。见图3。

图3 各组小鼠海马CA1区神经元细胞Nissl染色（×200）；与Sham组比较，★ P＜0.05；与BCAO组比较，# P＜0.05

2.4 各组小鼠海马区p-PI3K、p-AKT、GRP170、CHOP、caspase-12蛋白表达水平比较 BCAO组小鼠海马内CHOP和caspase-12与Sham组相比明显升高（P＜0.05），p-PI3K、p-AKT、GRP170均未见明显改变（P＞0.05）；经MaFGF处理后，CHOP和Caspase-12明显降低，而p-PI3K、p-AKT、GRP170表达明显增加（P＜0.05）。见图4。

图4 各组小鼠海马CA1区p-PI3K、p-AKT、GRP170、Caspase-12、CHOP蛋白表达水平比较；与Sham组比较，★ P＜0.05；与BCAO组比较，# P＜0.05

2.5 各组小鼠海马区p-AKT、GRP170免疫阳性颗粒的表达情况 p-AKT和GRP170免疫阳性颗粒均聚集在海马神经元胞浆内；BCAO组小鼠海马区p-AKT和GRP170免疫阳性颗粒表达量与Sham组比较差异无统计学意义；GRP170和p-AKT在BCAO+MaFGF组的分布均比BCAO组更趋致密。见图5。

3 讨论

酸性成纤维细胞生长因子（aFGF，FGF-1）是一种多功能生长刺激因子，因aFGF的特殊结构赋予其在血管再生、创伤修复、骨骼生长、神经保护等方面显示出卓越的临床应用价值，也成为了基础研究领域的热点［2］。但由于aFGF有丝分裂活性可能与细胞增殖、分化和肿瘤发生有一定的关系，使aFGF的应用受到一定限制。因此，本研究采用改构型aFGF观察其对慢性脑缺血再灌注损伤小鼠的神经保护作用。aFGF的N端第21～27位的氨基酸Asn-Tyr-Lys-lys-Pro-Lys-Leu是aFGF促有丝分裂活性的重要氨基酸序列，定向敲除该段序列的第23～26位氨基酸片段，由Met取代Leu，可使其失去促有丝分裂能力，同时保留了非促分裂活性结构域［4］。XU等［3］研究表明MaFGF明显减轻局灶性缺血再灌注大鼠的脑水肿程度和脑梗死面积，降低丙二醛含量，升高超氧化物歧化酶活性，对急性局灶性缺血再灌注大鼠发挥神经保护作用。本研究结果显示，MaFGF可明显降低BCAO组小鼠28 d时的mNSS评分，缩短逃避潜伏期，增加穿台次数，表明MaFGF能够改善慢性脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能和认知记忆力，发挥长期的神经保护作用。

图5 各组小鼠海马CA1区p-AKT、GRP170免疫阳性颗粒表达情况（×200）

脑缺血再灌注后，神经元细胞损伤主要表现为细胞凋亡，因此细胞凋亡是脑缺血再灌注损伤的中心环节和治疗主要靶点。内质网应激（ERS）、钙超载、氧化应激、炎性反应等诸多因素，均可导致细胞凋亡，其中内质网应激介导的细胞凋亡具有关键作用。当ERS过强或持续存在时，一方面内质网功能无法恢复，使细胞失衡转向凋亡，一方面诱导激活增强剂结合蛋白同源蛋白（CHOP）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶12（Caspase12）等激活细胞凋亡通路，通过凋亡清除受损严重的细胞。本研究结果显示，与Sham组比较，BCAO小鼠海马CA1区CHOP、Caspase-12表达明显升高，神经元细胞形态结构破坏严重，提示脑缺血再灌注损伤小鼠海马神经元细胞存在内质网功能障碍。葡萄糖调节蛋白170（GRP170），是驻留在ER中的主要分子伴侣，与GRP78具有相似的调控作用。有文献报道GRP170可以作为一种核苷酸交换因子（NEF），触发结合免疫球蛋白（BiP）核苷酸转录形成ATP-BiP，除了其公认的NEF活性外，其还包含一个C端保持酶阈，能够促进未折叠或错误折叠蛋白的降解，减轻内质网应激，从而起保护作用［5-6］。因此GRP170的高表达可以促进内质网功能的稳定，减少内质网应激相关细胞凋亡。本研究结果显示，与Sham组比较，BCAO小鼠海马区GRP170表达无明显改变，这可能是在发生ERS初期，GRP170应激性增多以激活未折叠蛋白反应（UPR），恢复内质网的功能；但ERS持续存在，使得GRP170大量消耗而逐渐减少。aFGF可通过抑制内质网应激发挥神经保护作用，HU等［7］应用aFGF鼻内给药1周持续治疗新生儿缺血缺氧型脑损伤，可显著减少脑梗死面积，通过抑制内质网应激发挥长期的神经保护作用。本研究结果显示MaFGF可上调BCAO小鼠海马区神经元细胞GRP170的表达，恢复内质网功能，降低CHOP、Caspase-12的表达水平，减少神经元凋亡。

FGF可通过与FGF受体结合，促使FGF受体磷酸化并产生酪氨酸蛋白激酶活性，启动PI3K途径、蛋白激酶C（PKC）途径、丝裂原活化蛋白酶（MAPK）途径等发挥其生物学效应，其中PI3K/AKT通路是aFGF在神经组织中发挥作用的主要信号途径［8-9］。外源性aFGF可通过激活PI3K-Akt-Rac1信号通路部分降低小分子G蛋白RhoA活性，从而改善脑外伤后的神经功能缺陷和保持血脑屏障完整性［10］。WANG等［11］研究发现bFGF可作用于靶细胞诱发PI3K信号通路级联反应，激活下游ERK1/2、AKT、GSK3β通路，抑制内质网应激反应（ERS），从而减少神经组织病变和神经细胞凋亡。本研究显示，MaFGF可增加BCAO小鼠神经元细胞PI3K、AKT的磷酸化，表明MaFGF可能是通过激活PI3K/AKT信号通路级联反应而发挥抗凋亡作用。

综上，MaFGF能够明显改善慢性脑缺血再灌注损伤小鼠的神经功能，改善认知和记忆能力，其可能机制是通过激活PI3K/AKT信号通路，减轻内质网应激，减少神经元细胞凋亡从而发挥神经保护作用。