类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞lncRNA-miRNA-mRNA 网络构建及关键基因预测

周新朋 金晔华 张润润 何东仪

1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属光华医院关节内科，上海 200052

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性炎症性疾病，以关节受累为主，引起关节软骨和骨的破坏，并最终导致关节的畸形[1]。其发病与遗传、性别、年龄、吸烟等密切相关[2]。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）是间充质来源的、具有成纤维细胞特征的滑膜细胞，是RA 发病过程中的主要的效应细胞[3]。

人类基因组绝大部分都可以被转录，但只有一小部分（大约2%）转录为mRNA，剩余部分则转录为不同种类的非编码RNA[4]。长链非编码RNA（lncRNA）是指长度超过200 nt，但不具有蛋白编码能力的RNA[5]。lncRNA 可通过竞争内源性RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）机制，通过微小RNA（miRNA）反应元件（microRNA response elements，MREs）竞争性结合miRNA，对基因的表达进行转录后调节[6]。

本课题组在美国国立生物技术信息中心的基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中获得RA-FLS 细胞的lncRNA 表达芯片数据集，将多个数据集进行合并，构建lncRNA-miRNA-mRNA网络并预测关键的lncRNA。

1 材料与方法

1.1 基因表达芯片数据集的获取

在GEO 中获取相关的数据集GSE103578、GSE8 3147、GSE128813，每个数据集中对照组含有3 个健康人滑膜分离的FLS，RA 组含有3 个RA 患者滑膜分离的FLS。使用limma 包[7]进行标准化，通过idmap3 包[8]对探针进行注释，根据基因名称将数据集合并，并去除批次效应。

1.2 差异基因的筛查

根据基因类型筛选mRNA 及lncRNA，通过limma包[7]分别进行基因差异表达分析，以logFC >1.0 并且P ＜0.05 的基因为差异表达基因。

1.3 构建lncRNA-miRNA-mRNA 网络

在lncbase[9]、starBase[10]、miRcode[11]数据库中，获得与差异表达的lncRNA 相关miRNA，在miRWalk[12]、TargetScan[13]数据库中寻找与mRNA 相关的miRNA，二者取交集，通过Cytoscape 软件[14]，构建lncRNAmiRNA-mRNA 网络，将网络中的lncRNA 作为关键lncRNA。

2 结果

2.1 芯片数据预处理

对获得的数据集进行注释及合并，得到对照组、RA 组各9 个样本，共有20 050 条基因的数据集，其中mRNA 有14 760 条、lncRNA 有5290 条。去除批次效应后各样本间数据达到一致性要求（批次效应处理前后数据集均一性变化如图1 所示），可以进行差异表达分析。

2.2 基因差异表达分析

分别对数据集中的mRNA 和lncRNA 进行差异表达分析。结果显示，与对照组比较，RA 组mRNA 上调31 条，下调56 条，见图2A；RA 组lncRNA上调9 条，下调14 条，见图2B。

图1 去除批次效应前后基因的表达情况

图2 基因差异表达分析

2.3 lncRNA-mRNA 共表达分析

对差异表达的mRNA 和lncRNA 进行Pearson 相关性分析显示，具有明显相关性的lncRNA 有18 条，mRNA有51 条（R ＞0.85 且P ＜0.05）。构造的lncRNAmRNA共表达网络见图3。

2.4 通过数据库构建lncRNA-miRNA-mRNA 网络

通过获取多个数据库的RNA 信息，得到与共表达的lncRNA、mRNA 有结合位点的miRNA，并取交集，获得相关miRNA，构建lncRNA-miRNA-mRNA 相关网络，其中lncRNA 有13 条，包括lncRNA XIST、NR2F2-AS1、LINC01018 等，miRNA 有26 条，mRNA 有46 条。lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络见图4。

3 讨论

图3 lncRNA-mRNA 共表达网络

FLS 是RA 血管翳中最常见的一种细胞类型，通过产生细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶及侵袭关节软骨导致关节的破坏。RA-FLS 与健康人滑膜FLS 比较，在细胞因子的表达、细胞信号通路的激活、原癌基因的表达方面存在明显不同[15]，这些不同可能与RA-FLS 的表观遗传学改变有关[16-17]。

lncRNA 的作用机制多样，可在转录和转录后改变基因的表达，调节各种生物学过程。最近发现可通过与miRNA 相互作用，改变miRNA 的表达水平，在转录后调节基因表达。lncRNA 与mRNA 竞争性结合MRE，可先通过计算机预测lncRNA-miRNA-mRNA 之间的相互关系[18]，为进一步实验验证提供指导。

有研究显示XIST 是多种肿瘤的原癌基因[19]，本研究发现XIST 在基因表达芯片中差异表达，并且与多个miRNA、mRNA 相互作用，Wang 等[20]发现XIST 在骨性关节炎（OA）样本中表达升高，XIST 及MMP-13、ADAMTS5 为miR-1277-5p 的靶基因，通过ceRNA 机制竞争性结合miR-1277-5p，导致MMP-13、ADAMTS5升高，促进细胞外基质的降解，RA 与OA 发病存在共有机制[21]，XIST 的研究对RA 骨破坏机制的研究具有参考意义。NR2F2-AS1 在多种肿瘤中具有重要作用，NR2F2-AS1 在非小细胞肺癌组织及细胞中表达升高，通过与BMI1 竞争性结合miR-320b 而与肿瘤的TNM 分期、患者的淋巴结转移相关[22]。LINC01018 在肝脏内可以通过RNA 结合蛋白HuR 调节脂肪酸氧化相关基因的表达[23]。肝癌细胞中LINC01018 的DNA甲基化水平改变，导致在肝细胞癌中表达水平下降，抑制肝癌细胞增生减弱[24]。

图4 lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络

lncRNA 在RA 中的作用已在多项研究中被证实，但是主要集中在HOTAIR、LincRNA-p21 等被广泛研究的lncRNA 中，其他lncRNA 在RA 中的作用还需要进一步寻找并验证[25]。本研究发现关键lncRNA 有13 条，可以构建复杂的lncRNA-miRNA-mRNA 网络，进一步揭示了lncRNA 在RA-FLS 细胞中的功能机制。