高效液相色谱-质谱/ 质谱法测定甲状腺片中7 种喹诺酮类药物的残留

赵文法 王春雷 冯家龙

山东省聊城市食品药品检验检测中心，山东聊城 252000

甲状腺是人体内最大的内分泌腺，分泌的甲状腺激素是维持人体正常代谢和生长发育所必需的激素。甲状腺功能低下或亢进可致体内甲状腺激素水平过低或过高，都会引起各种症状。甲状腺片为甲状腺激素药，是主要由猪、牛、羊的甲状腺经过加工制得的生化药品。有促进分解代谢（升热作用）和合成代谢的作用，对人体正常代谢及生长发育有重要影响，对婴幼儿中枢神经的发育甚为重要，临床使用量大，多用于治疗各种原因引起的甲状腺功能减退症[1-3]。甲状腺激素的基本作用是诱导新生蛋白质包括特殊酶系的合成，调节蛋白质、碳水化合物和脂肪三大物质，以及水、盐和维生素的代谢。由于甲状腺激素诱导细胞膜Na+-K+泵的合成并增强其活力，使能量代谢增强。甲状腺激素主要包括甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）两种。

甲状腺片为国家基本药物目录收载品种，现行法定标准为《中华人民共和国药典》[4]2015 年版二部，本课题组在检验过程中，在对该品种进行微生物限度方法适用性试验时，发现个别样品的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合规定，有一定程度的抑菌性。因该品种系取猪、牛、羊等食用动物的甲状腺体，为单一成分动物性组织，结合目前国内动物饲养存在抗生素滥用情况，本课题组推测其存在抗生素残留的可能性。抗生素在人体内蓄积，使人产生对抗生素的抗性，还可造成耐药菌感染，给临床治疗带来困难，严重时可引起各种组织器官病变，甚至癌变。在参考大量文献资料的基础上[5-15]，本课题组对甲状腺片中7 种喹诺酮类药物残留情况进行了研究，建立了液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）法，该方法检测灵敏度高、结果稳定、重复性好、准确度高，可用于甲状腺片中喹诺酮类药物残留的检测，保障临床用药的安全性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ACQUITY 超高效液相色谱仪（Waters），AB Sciex Q-TRAP 5500 三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）；AE240 电子天平（0.01 mg）（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q Integral 超纯水仪（Millipore 公司）。

1.2 试药

标准物质：恩诺沙星（Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号：50106，含量以99.2%计）、环丙沙星（农业部环境保护科研监测所，批号：201901，浓度100 μg/mL）、培氟沙星（农业部环境保护科研监测所，批号：201906，浓度100 μg/mL）、氧氟沙星（农业部环境保护科研监测所，批号：201906，浓度100 μg/mL）、洛美沙星（中国食品药品检定研究院，批号：201603，含量以90.4%计）、沙拉沙星（农业部环境保护科研监测所，批号：201901，浓度100 μg/mL）、诺氟沙星（农业部环境保护科研监测所，批号：201901，浓度100 μg/mL）。样品甲状腺片为2019 年度山东省药品质量风险监测计划“甲状腺片专项”抽检药品。甲醇、乙腈和甲酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITYUPLC®BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；以乙腈为流动相A，以1%甲酸为流动相B，按表1 中的规定进行梯度洗脱；流速：0.3 mL/min；进样量：10 μL；质谱检测器。

表1 梯度洗脱表

2.2 质谱条件

采用ESI，蒸发温度为550℃，气帘气压力为30 psi，喷雾气压力为55 psi，辅助加热气压力为55 psi，离子化电压为5500 V。选择正离子扫描方式，多反应检测模式（MRM），7 种成分的质谱参数见表2。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品储备液制备 分别精密称取恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和诺氟沙星对照品各适量，加甲醇制成各含1 μg/mL 的标准储备液。取恩诺沙星、洛美沙星、环丙沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星和诺氟沙星对照品储备液各适量用初始流动相分别制成1、5、20、50、100 ng/mL的标准系列溶液，备用。

2.3.2 供试品溶液制备 取本品研细，混匀，精密称取约2.0 g，置50 mL 具塞离心管中，加入4 mL 水，涡旋2 min，再加入10 mL 的1%乙酸乙腈，涡旋5 min，超声处理（功率400 W，频率40 kHz）30 min，放冷至室温，4000 r/min（离心半径=25 cm）离心5 min（温度低于5℃），上清液转移至50 mL 离心管中，重复提取，合并上清液，准确移取5 mL 于10 mL 离心管中，45℃下氮吹至近干，用1 mL 溶解液（乙腈∶水=2∶8）重新溶解，加乙腈饱和的正己烷3 mL，涡旋混合脱脂净化，5000 r/min 离心3 min，静置分层，取下层溶液用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液[8]。提取离子色谱图见图1。

表2 7 种成分的质谱参数

图1 7 种对照品提取离子流图

2.4 线性关系考察

取“2.3.1”项下标准系列溶液，按照“2.1”和“2.2”项下的条件进行测定。以对照品浓度（C）为横坐标，待测物质峰面积（A）为纵坐标，做标准曲线，得到线性回归方程，结果表明7 种成分在相应的范围内线性关系良好。见表3。

表3 线性关系结果及定量限

2.5 精密度试验

取浓度为20 ng/mL 混合对照品溶液，连续进样6 次，测得各被测成分峰面积的RSD 分别为恩诺沙星（1.5%）、环丙沙星（2.2%）、培氟沙星（1.8%）、氧氟沙星（1.7%）、洛美沙星（2.0%）、沙拉沙星（2.3%）、诺氟沙星（2.2%），表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取浓度为20 ng/mL 混合对照品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定，测得7 种被测成分峰面积的RSD 分别为恩诺沙星（2.3%）、环丙沙星（2.0%）、培氟沙星（2.5%）、氧氟沙星（2.2%）、洛美沙星（2.9%）、沙拉沙星（3.2%）、诺氟沙星（2.5%），表明其在24 h 内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的甲状腺片（批号：014180801）6 份，每份2.0 g，精密加入混合对照品溶液适量，按“2.3.2”项下方法制成低、中、高3 个不同浓度的供试品溶液，进样测定，计算回收率，7 种喹诺酮类药物平均加样回收率均在85.0%～100.0%范围内。分别为恩诺沙星（99.1%）、环丙沙星（90.8%）、培氟沙星（96.7%）、氧氟沙星（96.2%）、洛美沙星（98.8%）、沙拉沙星（89.2%）、诺氟沙星（91.5%），符合分析要求。见表4。

表4 加样回收率结果（n=6）

2.8 样品测定

按上述方法对收到的30 批样品进行检测，其中5 批样品检出氧氟沙星，5 批样品均来自同一生产企业，批号分别为180201、180803、180806、181004、190301，其他均未检出。检出氧氟沙星残留的5 批次样品与微生物限度检查方法适用性试验时，发现的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的回收率不符合规定的批次一致[16]。

3 讨论

甲状腺片系取猪、牛、羊等食用动物的甲状腺体，为单一成分动物性组织，结合目前国内动物饲养存在抗生素滥用情况，存在抗生素残留的可能性。抗生素在人体内蓄积，使人产生对抗生素的抗性，给临床治疗带来困难，抗生素还可以诱导一些微生物产生耐药菌株，导致人类过敏，甚至更大的危害。甲状腺片主要用于甲状腺功能低下和甲状腺功能减退患者，需要长期服药，药品中如果有抗生素残留，可能会对服用者产生一定危害，甲状腺片现行的质量标准没有抗生物残留检查项目，经笔者了解，因为缺乏相关的质量标准和参考依据，生产厂家对原料抗生素残留检验的种类和频次各不相同。建议尽快出台标准增加相关的检验项目，对甲状腺片及其原料中抗生素的含量进行控制，以便更好地控制甲状腺片的质量，以免对服用者产生危害。

喹诺酮类药物化学性质相似，分离困难，用常规液相色谱方法实现分离造成每次进样时间很长。LC-MS/MS 法表现出的高选择性、高灵敏度，不要求各成分完全分离，大大缩短了分析时间。采用质谱检测器，用MRM 方式测定，可以有效避免干扰，专属性更强，可以准确测定样品中药物残留的含量。通过试验优化了不同色谱柱和不同流动相体系，结果显示，采用ACQUITY UPLC®BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱，待测组分分离效果好，检测灵敏度较高。质谱分析中，对各被测成分的质谱参数进行了优化，喹诺酮类药物成分在正离子模式下有较高的响应和较好的峰形。

参考国家标准GB/T21312-2007[15]供试品制备方法[提取：称取均质试样5.0 g，置50 mL 离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L 的EDTA-Mcllvaine 缓冲液，1000 r/min涡旋混合1 min，超声提取10 min，10 000 r/min 离心5 min（温度低于5℃），提取3 次，合并上清液。净化：将提取的上清液以2～3 mL/min 的速度过HLB 固相萃取柱（200 mg，6 mL），弃去滤液，用2 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去淋洗液，将小柱抽干，再用6 mL 甲醇洗脱并收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干，用1 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，即得]。实验中分别考察了水、甲醇、乙腈作为提取溶剂，超声与涡旋两种提取方式。经提取条件优化，发现选用水提取，加入1%乙酸乙腈除去蛋白，加乙腈饱和的正己烷脱脂净化后，各被测成分峰形较好，提取率较高。

本研究建立了LC-MS/MS 法测定甲状腺片中7 种喹诺酮类药物的残留的方法，该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好，可用于甲状腺片中喹诺酮类药物残留的质量控制。