藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状的网络药理学研究

施 敏 刘富林 夏旭婷 张 婷 廖陈敏

湖南中医药大学中医学院，湖南长沙 410208

2019 年12 月以来，由新型冠状病毒感染引起的肺炎对全球人类健康造成极大威胁，其临床症状主要为发热、咳嗽、乏力等，并可能导致多种危急重症[1]。新型冠状病毒肺炎伴随的纳差、恶心呕吐、腹泻、黑便发生率分别为53.8%、21.3%、41.3%、2.5%[2]，这些胃肠道症状为目前临床的难点之一。疫情发生后，习近平总书记要求中医药进入防控疫情的主战场。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》[3]指出，可运用藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状，本文基于网络药理学分析藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状的作用机制，希望为后续研究提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 活性成分及作用靶基因、疾病靶基因的检索与交集靶基因的获取

借助中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以“藿香、紫苏、白芷、厚朴、大腹皮、半夏、陈皮、桔梗、茯苓、白术、甘草、生姜、大枣”为关键词检索，以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18 为标准，筛选化学成分及作用靶基因，并对靶点进行规范。通过GeneCards数据库、人类孟德尔遗传综合数据库（OMIM）以“Novel Coronavirus Pneumonia、diarrhea、nausea、vomiting”为关键词检索新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状的靶基因。将中药活性成分作用靶基因与疾病靶基因导入Venny 2.1 平台获取交集靶基因。

1.2 构建中药成分-靶基因网络图及核心成分筛选

借助Cytoscape 3.7.2 软件构建中药成分-疾病靶基因网络图，利用CytoNCA 插件进行拓扑分析，选取满足度值（Degree）和中心性（Betweenness）≥2 倍中位数的节点为藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状的核心成分。

1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）核心网络的构建

将交集基因导入String 数据库进行靶基因间的PPI 分析，物种选择为人，设定置信度＞0.4，得到PPI网络图，并借助R 语言构建核心网络。

1.4 核心靶基因的通路分析

应用R 语言，设定阈值为P ＜0.05，进行GO 和KEGG 通路分析，通过生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组成（CC）3 大模块进行GO 富集分析。

1.5 分子对接

选取核心靶基因和主要活性成分，在蛋白质结构数据库（PDB）下载靶点蛋白的结构，在TCMSP 下载化合物结构，导入SwissDock 进行对接。

2 结果

2.1 藿香正气散活性成分及作用靶基因、疾病靶基因、交集靶基因的筛选

经检索并筛选到藿香正气散活性成分224 个，对应作用靶点4026 个，去重后得到165 个活性成分和261 个作用靶基因，藿香正气散各成分和作用靶基因数见表1。新型冠状病毒肺炎靶基因有261 个、胃肠道症状有7756 个，其中交集靶基因50 个，见图1。

表1 藿香正气散活性成分及作用靶基因

图1 藿香正气散与新型冠状病毒肺炎靶基因韦恩图

2.2 藿香正气散活性成分-靶基因网络图及核心成分

藿香正气散活性成分-靶基因网络图见图2，其核心成分见表2。

图2 藿香正气散活性成分-靶基因网络图

2.3 PPI 网络的构建及核心靶基因

PPI 网络图和核心靶基因柱状图见图3。其中边代表靶基因之间的关联，边越粗（颜色越深），结合度越大；节点代表作用靶基因，共有49 个节点、477 条边。

图3 蛋白-蛋白相互作用网络与核心基因柱状图

2.4 核心靶基因的通路分析

GO 功能富集分析得到条目共1579 个，其中BP 为1456 个，MF 为33 个，CC 为90 个，其中各项基因数由多到少排序前五的见表3。KEGG 通路富集分析得到133 条信号通路，主要有肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、白细胞介素-17（IL-17）信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等。KEGG 通路富集分析结果前20 的条形图和气泡图（颜色代表富集程度，条形长度、气泡大小代表富集的基因数目）见图4。

图4 藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎的核心靶基因KEGG 富集分析

表2 藿香正气散核心成分

2.5 分子对接

分子对接结果见表4。蛋白质与小分子结合越紧密，其结合能越低，IL-6 靶点与柚皮素结合比较紧密（结合能=-4070.51 kJ/mol），见图5。

3 讨论

新型冠状病毒肺炎发于冬春季节，属于疫戾致病，结合本病高度的传染性和临床证候的相似性[4]，患者均以发热、干咳、乏力为主要表现，多伴恶心、脘痞、腹胀、便溏等胃肠道症状，属于中医疫病范畴，因感受外来疫戾之气，以湿为主，为湿毒疫，湿毒之邪波及中、下焦之脾胃、肠道，表现为湿困脾闭肺，肺失宣降，气郁身热。肺宣发肃降助气血津液分布于全身，宣发肃降功能正常，则大肠之气通畅，出入有常，分清别浊，反之则大肠传化失司，新型冠状病毒肺炎患者病位在肺，肺的宣发肃降功能失调，故患者出现腹胀、便溏等[5]。王遥等[6]认为肺肠合治，宣肺通腑、分消走泄、祛除疫邪为新型冠状病毒肺炎的关键治法。根据《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》[3]，新型冠状病毒肺炎临床表现为乏力伴肠胃不适者，推荐使用藿香正气相关中成药治疗。藿香正气散出自《太平惠民和剂局方》，有解表化湿、理气和中的功效，可改善免疫功能、抗菌、抗病毒、调节胃肠道功能、镇吐等，用于治疗肺系胃肠道疾病[7]。霍志鹏等[8]认为藿香正气散可减轻新型冠状病毒肺炎患者的炎症反应，有保护炎症导致的器官损伤作用，并可减缓炎症的进展速度，可能与降低促炎性细胞因子水平、升高IL-10 水平及调节炎症NF-κB 通路有关。

本研究提示藿香正气散中柚皮素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、陈皮素等化合物作用于新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状相关的原癌基因（JUN）、丝裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、MAPK14、促生存因子基因（BCL2L1）、表皮生长因子受体（EGFR）、IL-6 等50 个靶点。

柚皮素具有抗氧化、抗感染、抗肿瘤、抗凋亡等多种生物活性[9]。陈皮素具有抗感染、抗癌、抗血栓、抗癫痫、抗血凝、抗真菌、抗过敏、抗感染、抗胆碱酯酶等作用，并可缓解小鼠金黄色葡萄球菌肺炎的损伤[10-11]。木犀草素具有抗感染、抗病毒等药理作用，且有保护肺脏作用，可能与其抑制NF-κB 信号通路的表达、抑制IL-6、TNF-α 的释放有关，另外其还可干预细胞凋亡，达到抑制病毒的作用[12-14]。槲皮素具有降血压、抗氧化、抗感染、调节免疫功能等作用[15-17]。山奈酚对氧化应激及细胞凋亡均具有抑制作用，可减轻猪源甲型H9N2 流感病毒所致小鼠急性肺损伤[18-19]。

表3 藿香正气散治疗新型冠状病毒肺炎的核心靶基因GO 富集分析各项排序前五的条目

表4 分子对接结果（kJ/mol）

图5 白细胞介素-6 靶点与柚皮素的分子对接

JUN 被激活后可提升肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，新型冠状病毒肺炎病理过程中产生的各种细胞、炎症反应因子均可促进JUN 的表达[20]。MAPK8 在细胞增殖、分化、生存、死亡，炎症及其他病理过程中起着重要的调控作用，MAPK14 可通过炎性细胞因子的刺激被激活，可调节细胞的生长、分化及对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的病理生理过程[21]。BCL2 不仅能抑制多种细胞的凋亡，还可阻止细胞色素C 从线粒体中释放，使其不能与凋亡激活因子结合来抑制caspase 活性[22]。EGFR 可以通过结合表皮生长因子启动细胞核内信号的导转，参与调控EGFR 信号通路，抑制血管内皮细胞生长因子受体的表达，抑制酪氨酸激酶活性，减轻气道重塑与抑制气道炎症反应[23-24]。IL-6 作为非特异性炎症因子，在炎症早期就显著升高，参与肺脏炎症的发生、发展[25]。

富集分析结果发现藿香正气散的GO 功能富集主要体现在对细菌起源分子的反应、对氧化应激的反应、细胞对细菌起源分子的反应、细胞因子活性、磷酸酶结合等，主要通过调控与病毒感染和炎症及免疫相关的通路治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状。KEGG 通路富集分析筛选得到的通路主要有TNF 信号通路、IL-17 信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染等，大多数基因富集于与病毒有直接关系的通路上，可推断出藿香正气散通过作用于与病毒直接相关的通路，从而起到抗病毒的作用，机制是通过抗病毒、抗感染、调控细胞凋亡、调节免疫等途径。分子对接结果显示IL-6 靶点与藿香正气散主要成分柚皮素的结合比较紧密，柚皮素有与IL-6 受体结合的潜力，从而治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状。

藿香正气散中有效化合物可能通过多途径多通路作用于多靶点发挥抗病毒、抗感染及调节免疫等作用，提示藿香正气散可以通过多化合物-多靶点-多通路保护机体脏器、抗病毒、抗感染、调控细胞凋亡、调节免疫，治疗新型冠状病毒肺炎伴胃肠道症状，体现了中医药“多点显效，协同增效”的特点。