lncRNA FOXCUT调控Notch通路抑制结肠癌细胞增殖、侵袭的实验研究

佘明豪，刘寒松，杨文辉，余洋，张磊

结肠癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其中约90%的早期患者可通过手术切除治愈，但由于其早期临床症状不典型，多数患者确诊时已进入中晚期，严重威胁人类健康［1］。研究结肠癌的发病机制，寻找新的有效治疗靶点对于改善其预后、提高患者生存率和治愈率至关重要。长链非编码RNA（long non−coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，进化过程高度保守，可通过协同邻近编码基因表达发挥表观遗传、转录后调控功能，在结肠癌发生发展中起重要作用［2］。FOXC1 启动子临近转录体（FOXC1 promoter upstream transcript，FOXCUT）是一种位于促癌基因叉头框基因FOXC1 启动子上游的lncRNA。研究报道，FOXCUT在鼻咽癌［3］、结直肠癌［4］等多种癌症中表达上调，但关于其对结肠癌细胞生物学行为的影响尚鲜有研究。Notch信号通路由受体、配体及细胞内效应器3部分组成。已有研究证实，Notch信号通路激活在结肠癌中发挥重要作用［5］。本研究拟探究FOXCUT 对结肠癌细胞增殖、侵袭的影响及是否亦通过调节Notch信号通路发挥作用，以期揭示其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 Lipofectamine 2000 试剂盒（货号L7800）、CCK−8 试剂盒（CA1210）购自北京索莱宝科技有限公司；FOXCUT siRNA及其阴性干扰序列由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成；RNA提取试剂盒（货号DP419）购自天根生化科技（北京）有限公司；实时荧光定量PCR（qPCR）试剂盒（货号D7268S）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔源一抗 anti−Notch1（货号 ab52627）、anti−Hes1（货号 ab108937）、anti−β−actin（货号ab179467），二抗羊抗兔IgG（货号ab6721）均购自英国 Abcam 公司。7500qPCR 仪、Evolution220 紫外分光光度计、Forma Steri−Cycle i160 5%CO2培养箱购自美国Thermo Fisher 公司；MODEL550 型酶标仪购自美国 Bio−Rad公司；ix73荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 组织来源 选取2018 年1 月—2019 年5 月期间于郑州大学附属郑州中心医院收治的30例患者的结肠癌及其癌旁组织标本，均经病理学确诊。所有标本采集均取得患者及其家属知情同意并签字确认，经本院伦理委员会批准通过。

1.2.2 细胞培养 人结肠癌细胞株SW480、SW620、HCT116、HT29及人正常结肠上皮细胞NCM460（均购自中国科学院上海细胞库）采用含10%FBS、100 U/mL 青霉素和0.1 g/L链霉素的DMEM/F12培养基置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞进行传代培养，细胞传代采用0.25%胰蛋白酶消化处理。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期HCT116细胞接种至6孔细胞板，待细胞汇合至80%时，采用Lipofectamine 2000试剂盒转染FOXCUT siRNA（FOXCUT siRNA组）及转染阴性siRNA为阴性对照组（FOXCUT siRNA−NC组），另设正常培养HCT116细胞为正常对照组（NC 组）。其中FOXCUT siRNA 序列：5'−AGAU⁃AAUUGUCUUAGUUCUCCAUCG−3'；阴性 siRNA 序列：5'−CGUAGUGCGUAGUGCUAGUGCGUAG−3'。具体步骤严格按照试剂盒说明书进行，转染后48 h收集各组细胞进行相关实验检测。

1.2.4 qPCR实验检测FOXCUTmRNA表达 提取结肠癌组织、癌旁组织、结肠癌细胞、正常结肠上皮细胞及转染后各组细胞总RNA，反转录得到cDNA，置于−20 ℃保存备用。采用qPCR扩增FOXCUT及β-actin。其中FOXCUT引物：上游 5'−GTC⁃GCACCGATGACTAACG−3' ，下 游 5'−GCCCTCAAAGCC⁃GAACTG−3'；内参β-actin引物：上游 5'−GAGACCTTCAA⁃CACCCCAGCC−3'，下游5'−AATGTCACGCACGATTTCCC−3'。20 μL反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）10.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 μg/L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 31 s，40个循环。以β-actin为内参基因，FOXCUTmRNA相对表达水平采用2−ΔΔCt法进行定量分析。

1.2.5 CCK−8 实验检测转染后各组细胞增殖情况 取对数生长期HCT116细胞接种至96孔细胞板，接种密度分别为0、625、1 250、2 500、5 000、10 000、20 000、30 000、40 000个/孔，各设置3个复孔，待细胞完全贴壁后，每孔加入20 μL CCK−8溶液，37 ℃孵育3 h，酶标仪下测定各孔450 nm波长处吸光度（A）值，求各接种密度下均值A，以接种密度为横坐标，A值为纵坐标，绘制CCK−8标准曲线。根据CCK−8标准曲线，取对数生长期HCT116 细胞接种至96 孔细胞板，接种密度1×104个/孔，细胞分组同1.2.3，分别于转染48 h 后添加CCK−8 试剂，37 ℃孵育3 h 后，采用酶标仪检测各组细胞于450 nm 波长处A值。

1.2.6 集落形成实验检测转染后各组细胞克隆能力 各组HCT116 细胞培养14 d 后，采用纯甲醇固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下计数细胞集落，以≥50 个细胞团块计数为1 个集落。

1.2.7 Transwell 实验检测转染后各组细胞侵袭能力 将转染后各组HCT116 细胞用无血清培养基重悬，添加至包被Matrigel 的小室中，每个小室下室添加 500 μL 含 10%FBS 的DMEM/F12培养基，孵育48 h后弃去培养基，PBS洗涤后，4%甲醛固定，0.1%结晶紫染色，显微镜下随机读取5 个视野计数侵袭细胞，取其平均值。

1.2.8 qPCR 检测各组细胞Notch1、Hes1mRNA 表达 参照1.2.4方法检测各组细胞Notch1、Hes1及β-actin。其中Notch1引物：上游 5'−GCTGACCTGCGCATGTCTGCCATG−3'，下游5'−CATGTTGTCCTGGATGTTGGCATCTG−3'；Hes1引物：上游5'−GCACAGAAAGTCATCAAAGCCTATT−3' ， 下 游 5'−GCTATCTTTCTTCAGAGCATCCAA−3'。以β-actin为内参基因，计算Notch1及Hes1mRNA相对表达水平。

1.2.9 采用蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测转染后各组细胞中Notch1、Hes1蛋白表达 蛋白提取试剂盒提取总蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）法测定蛋白质浓度，依次进行SDS−PAGE、转膜、封闭，添加一抗 anti−Notch1（1︰2 000）、anti−Hes1（1︰1 000）、anti−β−actin（1︰2 000），4 ℃孵育过夜，添加二抗IgG（1︰5 000）室温避光孵育1 h，增强化学法显影，蛋白条带灰度值用Image J软件分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0 软件进行统计学分析，计量资料均采用均数±标准差（）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，多组间数据比较采用单因素方差分析（one−way ANOVA），组间多重比较采用Bonferroni 校正的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOXCUT 在结肠癌组织及结肠癌细胞中表达上调 与癌旁组织比较，结肠癌组织中FOXCUTmRNA 表达水平显著增高（t=9.660，P＜0.01），见图1A。与正常结肠上皮细胞NCM460 比较，结肠癌细胞株 SW480、SW620、HCT116、HT29 中FOXCUTmRNA 表达水平均显著增高（P＜0.01），其中以HCT116 细胞中表达水平最高，因此选择HCT116 细胞作为细胞载体进行下游试验，见图1B。NC 组与FOXCUT siRNA−NC 组 HCT116 细 胞 中FOXCUTmRNA 表达水平差异无统计学意义（t=0.540，P＞0.05）；与 FOXCUT siRNA−NC 组 比 较，FOXCUT siRNA 组 HCT116 细胞中FOXCUTmRNA 表达水平显著降低（t=12.316，P＜0.01），见图1C。

2.2 沉默FOXCUT 对HCT116 细胞增殖活力的影响 与 FOXCUT siRNA−NC 组（0.97±0.11）比较，FOXCUT siRNA 组 HCT116 细胞增殖活力（0.52±0.07）显著降低（t=8.454，P＜0.01），见图2。

2.3 沉默FOXCUT对HCT116细胞集落形成能力的影响 与FOXCUT siRNA−NC 组（127.49±16.35）比较，FOXCUT siRNA 组HCT116 细胞集落形成数量（38.17±10.81）显 著 减 少（t=11.162，P＜0.01），见图3。

Fig.1 Expression levels of FOXCUT in colon tissues and cells图1 FOXCUT在结肠组织及细胞中的表达水平

Fig.2 CCK−8 standard curve图2 CCK−8标准曲线

2.4 沉默FOXCUT对HCT116细胞侵袭的影响 与FOXCUT siRNA−NC 组（97.93±12.31）比较，FOXCUT siRNA 组HCT116 细胞侵袭数（38.83±10.97）显著减少（t=8.780，P＜0.01），见图4。

Fig.3 Effects of FOXCUT silencing on colony forming ability of HCT116 cells图3 沉默FOXCUT对HCT116细胞集落形成能力的影响

Fig.4 Effects of FOXCUT silencing on invasion of HCT116 cells(×400)图4 沉默FOXCUT对HCT116细胞侵袭的影响（×400）

2.5 沉 默 FOXCUT 对 HCT116 细 胞Notch1、Hes1mRNA表达的影响 与FOXCUT siRNA−NC组比较，FOXCUT siRNA 组 HCT116 细胞Notch1、Hes1mRNA表达水平显著降低（n=6，t分别为11.658、8.445，均P＜0.01），见图5。

Fig.5 Effects of FOXCUT silencing on Notch1 and Hes1 mRNA expression levels in HCT116 cells图5 沉默FOXCUT对HCT116细胞Notch1、Hes1 mRNA表达的影响

2.6 沉默 FOXCUT 对 HCT116 细胞 Notch1、Hes1 蛋白表达的影响 与FOXCUT siRNA−NC 组比较，FOXCUT siRNA组HCT116细胞Notch1、Hes1蛋白表达水平显著降低（t分别为 8.818、10.955，均P＜0.01），见图6。

3 讨论

Fig.6 Effects of FOXCUT silencing on Notch1 and Hes1 protein expressions in HCT116 cells图6 沉默FOXCUT对HCT116细胞Notch1、Hes1蛋白表达的影响

3.1 FOXCUT 在结肠癌组织及细胞株中的表达情况 lncRNA在人类基因组中含量丰富，主要通过染色体重塑、基因印迹、降解和翻译mRNA等形式发挥作用［6］。FOXCUT 是近年来新发现的一种 lncRNA，因位于FOXC1基因启动子上游而得名，而FOX家族可通过多种机制促进肿瘤细胞转移及侵袭，在结肠癌等恶性肿瘤进展中发挥重要作用［7］。孔祥盼等［8］研究报道，FOXCUT 在口腔鳞癌组织及细胞中高表达，抑制FOXCUT表达可体外抑制口腔鳞癌Tca8113细胞增殖和迁移。本研究发现，与癌旁组织及正常结肠上皮细胞相比，结肠癌组织及细胞株SW480、SW620、HCT116、HT29 中FOXCUTmRNA 表达水平均显著增高，提示FOXCUT可能起促癌样基因作用，其表达上调与结肠癌发生有关，但FOXCUT 与结肠癌细胞生物学行为的关系仍待进一步验证。

3.2 FOXCUT 对HCT116 细胞增殖、侵袭能力的影响 TCGA数据库显示FOXC1和FOXCUT在胃癌组织中高表达，与肿瘤直径、淋巴结转移、TNM 分期、分化程度有关；体外实验表明，抑制FOXCUT表达可抑制胃癌细胞增殖及侵袭，促进其凋亡［9］。本研究沉默 FOXCUT 后发现，与 FOXCUT siRNA−NC 组比较，FOXCUT siRNA 组 HCT116 细胞增殖活力、集落形成能力及侵袭能力均显著降低，再次验证了FOXCUT 在结肠癌细胞中的促癌样作用，抑制其表达可抑制其恶性增殖及侵袭行为。此外，检测FOXCUT表达有助于鼻咽癌［10］、头颈部肿瘤［11］、三阴性乳腺癌［12］等多种肿瘤的早期诊断及预后评估，因此推测FOXCUT可能作为结肠癌诊断的潜在生物标志物。

3.3 FOXCUT 影响HCT116 细胞增殖、侵袭能力的机制 Notch信号通路几乎涉及细胞所有的增殖、分化、凋亡、侵袭、迁移及血管形成等活动，Notch 受体是细胞正常发育的决定性因素，目前已鉴定4 种Notch受体及5个相应配体，其异常表达与肿瘤细胞增殖密切相关［13］。Hes1 是 Notch 下游关键靶基因。研究证实，抑制Notch 通路可引起Notch1、Hes1等相关基因表达下调，PTEN 表达增加，进而负性调节PI3K/Akt 通路，参与调控食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移［14］。本研究发现，下调 FOXCUT 可降低Notch1、Hes1 mRNA 及蛋白表达水平，提示下调FOXCUT 抑制结肠癌HCT116 细胞增殖及侵袭能力可能与降低Notch1、Hes1表达、抑制Notch 通路激活有关。熊祎虹等［15］发现，激活Notch1可促进结肠癌细胞及其干细胞增殖，促进肿瘤发生，证实Notch 通路激活在结肠癌细胞增殖、侵袭等生物学行为中发挥重要作用，因此推测FOXCUT可能通过调控Notch信号通路影响结肠癌细胞的增殖和侵袭行为。

综上所述，沉默FOXCUT可抑制结肠癌HCT116细胞增殖及侵袭，可能与抑制Notch 通路激活有关。本研究仅初步探究了FOXCUT 调控Notch 通路对结肠癌细胞生物学行为的影响，但关于FOXCUT 对Notch通路的调控作用是直接还是间接，是否还有其他信号通路参与，将是笔者下一步重点探究的内容。