TSA对不同糖浓度下小鼠海马神经元HT−22细胞凋亡的影响

许雯，许永劼，刘歆蕾，沈婕，朱科静，林海容，李兴，潘卫，△

糖尿病脑病（diabetic encephalopathy，DE）是由糖尿病引起的神经退行性疾病，其发病机制复杂，可能涉及氧化应激、炎症损伤、细胞凋亡等。研究发现糖尿病引起的学习和记忆缺陷可能由海马神经细胞凋亡介导［1−3］。本课题组前期研究发现高糖能诱导小鼠海马神经元HT−22 细胞凋亡，且随着糖浓度的增加，细胞凋亡率显著上升［4］。组蛋白乙酰化修饰在糖尿病及其并发症的发生发展中起着重要作用［5］，其在组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的共同调控下能保持动态平衡，且对基因表达调控发挥重要的作用。组蛋白乙酰化与神经细胞凋亡相关［6］，HDACs SIRT6 能调控糖尿病视网膜病变的早期神经退行性病变［7］。但是，目前组蛋白乙酰化在DE 中的作用尚不清楚。曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）是一种广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），它能通过增加细胞内组蛋白的乙酰化程度诱导细胞凋亡［8−9］。本研究利用TSA处理HT−22细胞，观察HDACs对神经细胞凋亡的影响，为研究DE的发病机制提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 小鼠海马神经元HT−22 细胞（中乔新舟公司）；0.25%胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；TSA（美国CST公司）；兔源β−肌动蛋白（β−actin）多克隆抗体、兔源Bcl−2 相关X 蛋白（Bax）多克隆抗体、兔源B 淋巴细胞瘤−2（Bcl−2）多克隆抗体、兔源半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase−3）多克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体（武汉三鹰公司）；CCK8试剂盒（日本同仁公司）；酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；RIPA高效裂解液、BCA 蛋白定量试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；Annexin V−FITC/PI细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）。CO2培养箱（日本SANYO 公司）；倒置相差显微镜（日本Nikon 公司）；Western blot 电泳仪、IMARK 型酶标仪（美国Bio−Rad公司）；流式细胞仪（美国Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取冻存的HT−22细胞于37 ℃水浴箱中复苏，加入3 mL含有10%胎牛血清的DMEM培养基，600 r/min，离心5 min，弃上清加入1 mL培养基重悬细胞，将细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养、传代，取对数生长期的HT−22 细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞分组 取对数生长期的HT−22 细胞分别用高糖培养基（葡萄糖浓度55 mmol/L）及普通培养基（葡萄糖浓度25 mmol/L）培养，高糖培养基及普通培养基各分为2组：对照组（NC组）、抑制剂组（TSA组，加入TSA干预细胞）。

1.2.3 TSA 母液制备 取 1 mg TSA 溶于 826 μL DMSO 溶剂中，得到浓度为4 mmol/L 的TSA 母液，使用时用培养基稀释到相应浓度，剩余放置于−20 ℃储存。

1.2.4 CCK8 法检测细胞存活率 待细胞长到对数生长期，胰酶消化细胞，以1×105/mL密度均匀接种于96孔板，置于培养箱中培养24 h。实验分组按照1.2.2，同时另设置空白组（不含细胞仅含有培养基）；分别用1 mmol/L 的TSA作用TSA组细胞1、4、8 h，以及之后用0.4 mmol/L的TSA作用TSA组细胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，每组设置5个复孔，用高糖培养基及普通培养基分别将TSA 母液稀释成相应浓度，以每孔100 μL 替换TSA 组原培养基；相应作用时间结束，弃去各组培养基，每孔加100 μL检测液（90 μL培养基+10 μL CCK8试剂），避光放于37 ℃，5%的CO2培养箱中，反应2.5 h后，酶标仪检测450 nm 处的光密度（OD）值。细胞存活率=（TSA 组OD 均值−空白组OD 均值）（/NC 组OD 均值−空白组OD 均值）×100%。选择最适的作用时间和浓度为后续实验的抑制剂作用条件。

1.2.5 ELISA 法检测HADC 和HAT 活性 在酶标包被板上设标准品孔、空白孔、实验孔，实验孔分组按照1.2.2，用浓度为0.4 mmol/L的TSA作用TSA组20 h。标准品孔加不同浓度的标准品各50 μL，实验孔加各组细胞裂解液各50 μL，空白孔不加；除空白孔外，其余孔各加HPR 标记的山羊抗兔抗体100 μL，经温育、洗涤后，各孔加显色剂 100 μL 避光反应15 min 后，各孔加终止液50 μL。用空白孔调零，酶标仪在450 nm 处检测各孔OD 值，测定在加终止液后的15 min 内完成，计算出样品的浓度。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 分组按照1.2.2，用浓度为0.4 mmol/L 的 TSA 作用 TSA 组 20 h 后收集细胞悬液，用 PBS洗 2 次，加入 500 μL Binding Buffer 重悬细胞，加入 5 μL Annexin V−FITC 混匀，再加入5 μL Propidium Iodide 混匀，室温避光反应10 min，1 h以内上机检测细胞凋亡率。

1.2.7 Western blot 检测凋亡相关蛋白Bcl−2、Bax、Caspase−3表达情况 用浓度为0.4 mmol/L的TSA作用TSA组20 h后提取各组细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，用RIPA稀释蛋白液，将各组蛋白浓度调至一致，按4∶1 体积加入5×loading buffer，混合液煮沸 10 min，使蛋白变性。以30 μg 为统一上样量，浓度为12%的分离胶，通过SDS−PAGE 凝胶电泳分离目的蛋白，再将目的蛋白转移到PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2 h，TBST 漂洗3 次，孵育一抗 β−actin（1∶5 000）、Bcl−2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Caspase−3（1∶2 000）于4 ℃摇床过夜，TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，孵育二抗羊抗兔 IgG（1∶20 000）于室温摇床1.5 h。ECL法显影，收集图像，Image J软件进行分析，实验独立重复3次，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件分析处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，2 组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TSA 最适作用时间和浓度 CCK8 结果显示，以1 mmol/L的TSA作用HT−22细胞1 h时，细胞存活率在80%左右；作用4 h 时，细胞存活率在60%左右；作用8 h时，细胞存活率＜50%。以0.4 mmol/L的TSA 作用 HT−22 细胞作用时间≤14 h 时，细胞存活率≥80%；作用16 h 时，普通培养基中细胞存活率为81%，高糖培养基中细胞存活率为73%；作用20 h时，高糖和普通培养基中的细胞存活率都在70%左右；作用24 h时，细胞存活率均＜50%。后续实验以0.4 mmol/L、20 h为TSA最适作用条件，见图1。

Fig.1 The effects of different action time on HT−22 cell activity图1 TSA不同作用时间对HT−22细胞活性的影响

2.2 TSA 对不同糖浓度下HDAC 及HAT 活性的影响 在普通培养基和高糖培养基中，TSA 组HDAC浓度较NC组均减少，HAT增加（P＜0.05）。同时，高糖作用后 NC 组和TSA 组的HDAC 和 HAT 增加（P＜0.05），见表1。

2.3 TSA 对不同糖浓度下HT−22 细胞凋亡率的影响 在普通培养基和高糖培养基中，TSA组均较NC组细胞凋亡率增加（P＜0.05），且高糖培养基比普通培养基培养的细胞凋亡率更高（P＜0.05），见图2、表2。

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞HDAC和HAT活性的影响 （n=5，）

Tab.1 The effects of TSA on HDAC and HAT activities of HT-22 cells under different concentrations of glucose表1 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞HDAC和HAT活性的影响 （n=5，）

＊P＜0.05

组别NC组TSA组t HDAC（pmol/L）普通培养基28.19±0.64 17.62±0.58 27.320＊高糖培养基61.17±1.67 53.27±1.06 8.912＊t 41.089＊65.936＊组别NC组TSA组t HAT（μg/L）普通培养基29.48±0.71 42.41±0.87 25.766＊高糖培养基33.94±1.09 45.32±0.66 19.940＊t 7.649＊5.960＊

2.4 TSA 对不同糖浓度下凋亡相关蛋白表达的影响 Western blot 结果显示，在普通培养基和高糖培养基中，NC 组与TSA 组Bax 表达均无显著差异。TSA组均较NC组Bcl−2表达显著下降，Caspase−3表达显著增加（P＜0.05），见图3、表3。

3 讨论

DE是糖尿病最严重的并发症之一，认知功能障碍是其重要的临床特征。糖尿病会增加阿尔茨海默病和血管性痴呆发生的风险［10］。神经元凋亡和海马神经受损是认知/记忆功能障碍（包括阿尔茨海默病）的主要因素［11］。研究发现，大脑的肥大细胞作为脑损伤的“第一反应者”在被激活后，会引起小胶质细胞激活和神经元凋亡，进而导致认知功能障碍［12］。另外，表观遗传机制已被证明对于调节神经元基因表达至关重要，从突触可塑性到学习和记忆，其在许多神经元功能中扮演着重要的角色，特别是组蛋白乙酰化在这些过程中起重要作用［13］。HATs 和HDACs参与认知功能的调控，不同HAT或HDAC的突变或失调会导致神经功能障碍和神经变性。研究发现，HDAC2在赖氨酸乙酰化与突触可塑性偶联中起核心作用，并在认知障碍疾病中发挥重要作用［14］。同时，组蛋白乙酰化也影响神经细胞的凋亡。研究发现组蛋白乙酰化水平增加可通过减少大脑皮层细胞凋亡及促进神经元再生保护新生大鼠大脑皮层损伤，其机制可能与脑源性神经营养因子（BDNF）表达增加相关［15］。本研究以小鼠海马神经元 HT−22 细胞为研究对象，发现在高糖作用后细胞凋亡增加，并且HAT及HDAC也显著增加。

Fig.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT−22 cells under different concentrations of glucose图2 TSA对不同糖浓度下HT−22细胞凋亡率的影响

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞凋亡率的影响（n=3，%，）

Tab.2 The effect of TSA on apoptosis rate of HT-22 cells under different concentrations of glucose表2 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞凋亡率的影响（n=3，%，）

＊P＜0.05

组别NC组TSA组t普通培养基6.00±0.20 27.43±0.55 63.357＊高糖培养基20.57±0.78 47.97±2.16 20.680＊t 31.456＊15.958＊

Fig.3 The effect of TSA on the expression of Bcl−2,Bax and Caspase−3 in HT−22 cells under different concentrations of glucose图3 TSA对不同糖浓度下HT−22细胞Bcl−2、Bax和Caspase−3表达影响

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表达情况的比较 （n=3，）

Tab.3 Comparison of TSA on the expressions of Bcl-2,Bax and Caspase-3 in HT-22 cells under different concentrations of glucose表3 TSA对不同糖浓度下HT-22细胞Bcl-2、Bax和Caspase-3表达情况的比较 （n=3，）

＊P＜0.05

组别NC组TSA组t普通培养基Bcl−2 1.16±0.06 0.46±0.02 19.729＊Bax 1.00±0.06 1.08±0.04 1.925 Caspase−3 0.84±0.06 1.07±0.06 4.903＊组别NC组TSA组t高糖培养基Bcl−2 0.78±0.02 0.45±0.01 27.494＊Bax 1.06±0.04 1.09±0.04 1.030 Caspase−3 0.99±0.05 1.29±0.03 8.395＊

TSA 是一种广谱的 HDACi，属于 HDACi 氧肟酸盐类，可作用于Ⅰ、Ⅱ类HDAC。TSA 可通过上调Caspase−8、Caspase−3 和 BH3 相互作用域死亡激动剂（Bid）等细胞中的促凋亡蛋白，下调Bcl−X1、髓样细胞白血病蛋白−1（Mcl−1）和X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）等促进凋亡信号转导，或通过线粒体介导的死亡途径诱发细胞凋亡［16］。本实验通过CCK8法检测细胞活性，确定TSA 的最佳作用时间和浓度。TSA推荐的作用时间和浓度是12～18 h、0.4 mmol/L。但也有研究报道，通过CCK8 法确定TSA 处理肺腺癌A549细胞、肺鳞癌H520细胞的最适药物浓度，即选取2.25～150 mmol/L间不同作用浓度，但是都是统一作用48 h，并没有对时间进行确定［17］。笔者先以1 mmol/L 的TSA 作用细胞，发现对细胞活性的影响过大，不利于后续实验；之后又用0.4 mmol/L分别作用各组细胞1、4、8、12、14、16、20、24 h，发现在20 h时抑制效果明显，且不影响细胞的存活。因此，最终选择0.4 mmol/L，20 h为最适作用条件。

Wei 等［18］发现 HDAC5 及其细胞内易位是调节神经元凋亡的多种途径的关键效应因子。HDAC5均匀地分布于皮层神经元的细胞核和细胞质中，当N−甲基−D−天冬氨酸（NMDA）诱导的细胞发生凋亡时，核内的HDAC5 被快速磷酸化并转移到细胞质，皮层神经元中核定位的HDAC5 的异位表达抑制了NMDA 诱导的细胞凋亡，在加入TSA 处理细胞后可抑制HDAC5对NMDA的作用，促进神经元凋亡。本研究通过抑制HDAC，观察组蛋白乙酰化修饰是否影响小鼠海马神经细胞HT−22 的凋亡，并利用TSA作用于正常及高糖条件下培养的HT−22 细胞，观察其对细胞凋亡是否有影响。

组蛋白乙酰化和去乙酰化在神经元老化、萎缩和退行性疾病中起重要作用。Wang 等［19］发现TSA可能通过抑制多巴胺能神经元的存活率和增加其对神经毒素的易感性参与帕金森的发病过程。Salminen等［20］发现TSA能影响大鼠小脑颗粒神经元和小鼠神经母细胞瘤细胞的代谢，高水平的组蛋白乙酰化可诱导神经元应激反应和细胞凋亡发生。本研究中ELISA 结果显示，TSA 作用后HDAC 活性降低，HAT活性增加；流式细胞术检测发现细胞凋亡率显著增加，且在高糖条件下，细胞凋亡更严重；在蛋白水平上，TSA 能显著下调 Bcl−2 的表达，上调Caspase−3 的表达。这些结果表明TSA 可能通过抑制HDAC 增加组蛋白乙酰化水平，诱导小鼠神经元HT−22细胞的凋亡。

综上所述，TSA能诱导HT−22细胞的凋亡，并且在高糖条件下，TSA对HT−22细胞凋亡的影响更大。TSA可能通过增加组蛋白乙酰化水平诱导神经细胞凋亡，从而参与DE认知功能障碍的机制。