肠道菌群结构特征在血压大幅升高患者的预测价值

王 攀，左 琨，韩春明，钟久昌，赵 蕾，董 莹，张大鹏，李 晶

0 引 言

高血压是心血管疾病和脑卒中的主要危险因素，全球每年约有940万人因高血压死亡[1]。血压水平与心脑血管病发病和死亡风险存在密切的因果关系。在对全球 61个40～89 岁人群的前瞻性观察研究中，发现诊室血压与脑卒中、冠心病事件、心血管病死亡的风险呈连续、独立、直接的正相关关系[2]。血压水平与心力衰竭发生也存在因果关系。临床随访资料显示，随着血压水平升高，心力衰竭发生率递增[3]。长期高血压-左心室肥厚-心力衰竭构成一条重要的事件链。同时，高血压也是心房颤动发生的重要原因[4]。因此，探究血压大幅升高人群的疾病特征，对高血压的早期预警早期诊断意义重大。

人体内定植着超过100万亿的微生物[5]。肠道菌群参与机体的营养代谢、免疫调节、炎症反应以及内分泌调节等生理过程[6]。研究发现，肠道菌群的紊乱失调通过改变代谢产物、炎症免疫、中枢神经系统等多种途径，参与高血压疾病的发生发[7]。研究者发现，如果血压大幅升高，老年时大脑体积明显缩小，且容易出现白质病变[8]。然而，在血压大幅上升的人群肠道微生物的结构特征尚未见报道。本研究通过前瞻性随访研究，对基线时血压大幅上升的人群的基线时期肠道菌群微生物进行前瞻性分析研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取河北省唐山开滦集团公司员工的队列进行研究。以平均动脉压(mean arterial pressure， MAP)为评价指标，随访2年(2014年5月-2016年5月)。血压测量采用诊室血压，取3次诊室血压测量的平均值，每次间隔5 min。纳入基线时期未应用降压药物首诊的高血压患者。最终纳入MAP变化大于0 mmHg的研究个体，合计52例。将MAP上升的幅度≥10 mmHg患者纳入上升组(33例)；将上升<10 mmHg患者纳入对照组(19例)。排除癌症、心力衰竭、肾功能衰竭、吸烟、卒中和外周动脉疾病，糖尿病或高胆固醇血症的患者；以及采样前8周内服用过抗生素或益生菌的个体。所有研究对象均已签署知情同意书。本研究通过医院伦理委员会批准(2018-科-18)。

1.2宏基因组测序本研究队列样本在前一项研究中已经进行粪便样本的DNA提取和宏基因组测序，原始测序数据已上传至欧洲核甘酸档案(ENA)数据库(http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB13870)[9]。本研究纳入前一项研究的队列中，共计52例样本的宏基因组数据进行深入分析。

1.3肠道菌群生物多样性指数计算α多样性分析：通过分析属级别和种级别的多样性指数、丰富性指数和均一性指数判定肠道菌群的α多样性特征。α多样性指数应用QIIME (Version 1.7.0)计算； 丰富性指数和均一性指数应用R software (Version, 3.3.3)中vegan package计算。β多样性分析用于评估样品间细菌群落复杂性的差异，使用UniFrac软件对样品进行差异分析，包括UPGMA聚类树分析、主成分分析、主坐标分析和非度量多维定标。

1.4肠型分析根据属的相对丰度，采用Jensen-Shannon散度法和medoids法对各样品的群落类型进行聚类。使用Calinski-Harabasz index16评估集群的最佳数量。设定平均相对丰度≥10-4且在≥6个样本中出现的属将进行最终分析。

本研究中，通过探究LVMAP和HVMAP两组在基线时期的肠道微生物群落结构差异。采用PAM聚类划分方法，根据菌属的丰度确定肠型。根据Calinski-Harabasz (CH)索引，最佳肠型数为2种。利用JensenShannon距离进行主坐标分析。将样本划分为2种不同的肠型。拟杆菌Bacteroide为肠型1中含量最高的主导菌属；普氏菌Prevotella为肠型2中含量最高的主导菌属。

1.5厚壁菌门与拟杆菌门细菌比值计算对测序得到的原始数据进行过滤处理以获得有效数据。基于有效数据进行进行宏基因组组装、物种注释及丰度分析，进而计算各样本中厚壁菌门与拟杆菌门细菌所占丰度。

1.6统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行计算，非正态分布计量数据以M(P25，P75)表示，组间比较采Wilcoxon秩和检验。并用Benjamini和Hochberg方法校正P值进行多次检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 组间基线参数比较2组患者基线参数差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2患者肠道菌群生物多样性的比较

2.2.1α多样性本研究中α多样性的研究结果表明，在生物多样性方面，无论在属级别或是种水平，两组患者α多样性指数(属级别：2.72±0.43vs2.79±0.47；种级别：3.77±0.64vs3.88±0.50)，丰富性指数(属级别：754.00±212.47vs695.00±148.24；种级别：2475.00±600.52vs2282.00±435.47)以及均一性指数(0.29±0.065vs0.282±0.07；种级别：0.49±0.07vs0.51±0.06)，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图 1。提示血压大幅升高人群在基线时期的肠道菌群的α多样性并无显著性改变。

表 1 各组患者基线参数比较

图 1 上升组与对照组患者基线肠道菌群α生物多样性比较

2.2β多样性在本研究中β多样性分析结果显示，在属级别和种级别，2组样本在非度量多维定标、主成分分析、主坐标分析的散点分布图中，组间差异无统计学意义(P>0.05)。见图 2。表明血压大幅升高人群在基线时期的肠道菌群β多样性与对照组相似。

图 2 上升组与对照组患者基线肠道菌群β生物多样性比较

2.3肠道微生物群落结构在肠型分布的比较为探究2组患者基线时期的肠道微生物群落结构差异，进一步分析2组人群在拟杆菌和普氏菌代表的两种不同肠型中的分布情况，见图3。拟杆菌Bacteroide为肠型1中含量最高的主导菌属；普氏菌Prevotella为肠型2中含量最高的主导菌属(P1=3.32e-08，P2=1.61e-14)，见图3。研究结果发现，HVMAP组患者更多分布于Bacteroide肠型，而LVMAP组样本更倾向于分布在Prevotella。2组人群在Bacteroide肠型的比例分别为43.3%和56.7%。在Prevotella肠型的比例分别为56.7%和43.3% ，见图3。

2.4厚壁菌门/拟杆菌门比例2组人群中物种相对丰度差异无统计学意义(0.53±0.39vs0.61±0.52，P=0.72)，见图3。结果表明，血压大幅升高人群在基线时期的肠道菌群厚壁菌门/拟杆菌门比例尚无显著性改变。

图 3 上升组与对照组患者基线肠道微生物群落肠型与比较

3 讨 论

高血压是心血管疾病最常见的可改变的危险因素。2015年的一项研究表明，肠道菌群稳态失调与高血压之间具有直接的相互关联性[11]。高血压相关的肠道菌群稳态的失调主要表现为，厚壁菌门与拟杆菌门比例升高，肠道微生物的丰富性显著降低；产生醋酸盐、丁酸盐的肠道细菌显著减少，而产生乳酸盐的细菌显著增加。本团队前期研究结果表明，在高血压前期和高血压人群中，微生物丰富度和多样性显著降低，与健康状态相关的细菌减少，普氏菌和克雷伯菌过度生长[10]。此外，高血压前期组的微生物群特征与高血压组非常相似。近年来，越来越多的证据表明，肠道菌群的紊乱失调与高血压之间甚至存在着因果关系，肠道微生物参与了高血压疾病的发生和发展[12]。一项研究中，与常规小鼠相比，无菌小鼠对AngII的升压反应减弱，表明肠道菌群介导了血管紧张素诱发的血压升高[13]。高血压能够塑造宿主肠道菌群，而改变肠道微生物同时也具有调节血压的作用。

因此，本研究在前期研究的基础上，通过前瞻性的研究，随访队列人群2年后的血压变化，对比MAP大幅上升患者与对照组在基线时的肠道菌群结构特征，试图分析肠道菌群结构变化特征对平均动脉压大幅上升患者的预测价值，探索潜在的促进血压进行性升高的肠道微生物结构特征，为高血压的防治提供新的策略和思路。本研究分别纳入MAP上升≥10 mmHg及<10 mmHg的患者，分析其血压变化前的基线时期，肠道菌群的生物多样性及肠型特点。结果显示，两组并差异无统计学意义。说明基线时MAP大幅上升人群的肠道微生物结构特征与对照组相似，提示肠道微生物群落结构的紊乱失调的程度对平均动脉压大幅上升的预测价值有限。

既往多项研究表明，研究者认为肠道微生物在多种疾病中具有预测和早期诊断疾病的潜力。梭杆菌，脆弱拟杆菌和肠致病性大肠杆菌均是结直肠癌的致癌菌，作为生物标志物时具有预测价值[14]。这些研究表明，肠道微生物组可作为结直肠癌早期筛查的有效工具[15-16]。另外，桥本甲状腺炎患者肠道菌群发生改变，且肠道菌群与临床参数相关，提示肠道菌群组成数据可用于疾病诊断[17]。此外，怀孕前和怀孕期间的微生物群调节和修饰可能为预防和治疗减少超重和肥胖的风险提供新的方向[18]。但本研究中析结果发现，两组患者在基线时期肠道菌群结构特征十分类似，对未来宿主的血压水平上升并不具有足够的预测价值，也提示可能存在肠道菌群以外的其他生物学特征作为血压上升的预测生物标志，仍待进一步研究和探索。

综上所述，本研究结果表明，基线时平均动脉压大幅上升人群的肠道微生物结构特征与对照组相似，肠道微生物群落结构的紊乱失调的程度对平均动脉压大幅上升的预测价值有限。