两种术式大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型建立的对比研究

胡 彦，王锁刚，翟琼瑶，王 帝，汪绪祥，朱时玉，王光策

0 引 言

肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是一种临床中常见的病理生理过程，指肾组织在缺血后再次获得血流灌注或氧供应后所产生的损伤，常见于失血性休克、肾动脉阻断以及肾移植等情况[1-2]。肾属于人体中高灌注血流器官，对缺血及再灌注损伤十分敏感，在发生缺血再灌注损伤后会出现活性氧、趋化因子和炎症反应、细胞凋亡等加剧组织损伤，是造成急性肾衰竭和移植肾功能延迟恢复的常见原因[3-7]。国内外大量学者通过构建该动物模型来研究其发生机制及预防措施，常见的建模手术途径为腹部切口和背部切口。本研究通过经背部手术途径同时阻断双侧肾蒂成功、稳定地建立了大鼠急性肾缺血再灌注损伤模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SPF级SD大鼠，48只，由郑州市华兴实验动物养殖场提供，实验动物许可证号：SYXK(豫)2016-0002，6～8周龄，体重(180±20)g，雄性，标准SPF级饲料饲养，自由饮水，饲养条件为室温20～25 ℃, 相对湿度45%～70%，保持通风。

1.2实验试剂和仪器血肌酐、尿素氮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，4%多聚甲醛溶液、苏木素-伊红染液(北京索莱宝科技有限公司)，IL-6、TNF-α试剂盒(江苏酶免有限公司)，酶标仪(MUL TISKAN FC, 美国)，光显微数字成像分析系统 (Kodak，美国)，高性能冷冻台式离心机 (ST40R，Thermo公司)，低温冷冻切片机(HD-1800)、石蜡包埋机(HD-310B)、脱水机(HD-300)、摊片机(HD-330)，均购于湖北惠达有限公司。

1.3造模方法

1.3.1 动物分组适应性饲养1周,随机数字表法将48只SD雄性大鼠随机分为：正常对照组、腹部手术组、背部手术组，造模术后24 h 对各组大鼠采血并取材(n=8)，剩余各组大鼠术后继予以蒸馏水灌胃处理30 d(n=8)，每天上午8点灌胃1次，同条件下饲养并密切观察。

1.3.2手术过程①麻醉：术前12 h禁食，麻醉前称量，采用3%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射。②游离及暴露双侧肾蒂：麻醉后，腹部手术组大鼠呈仰卧位固定于操作台，备皮、消毒铺巾后，从腹部正中部位切开皮肤及肌肉，切口长约4～5 cm，进入腹腔后将肠管推至一旁，充分暴露双肾及肾蒂；背部手术组大鼠采取俯卧位从背部脊柱正中位置切开皮肤，切口长约3 cm，于双侧肋弓下缘0.5 cm(双侧距脊柱中线约0.5～1.0 cm)肌肉薄弱部位切一纵行切口，进入腹膜外间隙后见肾周脂肪组织，钝性分离肾周脂肪组织，可见肾及肾蒂，充分暴露肾蒂；正常对照组无处理。③阻断肾蒂方法：用无创微型动脉夹同时夹闭双侧肾蒂，5 min内肾由鲜红色变紫黑色，则夹闭成功；夹闭持续时间为45 min，取除动脉夹后，恢复肾血流灌注，可见肾颜色由紫黑色逐渐变为鲜红色，表明肾恢复灌注良好，然后逐层缝合切口，缝闭伤口后再次碘伏消毒。

1.3.3造模成功判定夹闭双侧肾蒂后，5 min内肾由红棕色变成紫黑色，表明血流被阻断；45 min后松开微型动脉夹，5 min内肾变为红棕色，则认为缺血再灌注成功。

1.4实验相关指标检测

1.4.1 一般情况观察SD大鼠术后24 h精神、食量、大便情况等。

1.4.2肾功能生化指标检测采血后静置20 min，以离心半径9 cm、3000 r/min离心10 min后，留取上层血清，应用肌酐、尿素氮检测试剂盒分别测定大鼠血清肌酐、尿素氮水平。

1.4.3血清IL-6、TNF-α表达水平检测离心后取上清，根据对应的ELISA试剂盒步骤绘制出标准回归曲线，通过各孔样品的A值计算出IL-6、TNF-α含量。

1.4.4肾系数的测定麻醉前称量大鼠体重，过量麻醉处死后迅速摘取双肾，纱布擦净后称重，肾系数公式如下：

肾系数=双肾质量(g)/体重(100g)×100%

1.4.5肾组织病理学检测取各组大鼠新鲜肾组织，4%甲醛溶液固定，常规脱水，包埋，制片，烘干后HE染色，在显微镜下观察大鼠肾组织病理形态学改变。

1.4.6肾小管坏死半定量评分通过HE染色观察肾皮质及外髓区域上皮细胞坏死、刷状缘丢失、肾小管扩张情况，每个玻片在×400高倍镜下选取10个区域对肾小管坏死百分比进行统计[8]，评分原则如下：0分：无损伤；1分：<10%；2分：11%～25%；3分：26%～45%；4分：46%～75%；5分：>75%。由两名技术人员盲法进行评估平均值计算。

1.4.7体重术后30 d观察大鼠的一般情况，每3天测量记录体重值。

1.4.8肠梗阻发生率及腹腔感染率的比较术后30 d内密切观察大鼠存活情况、肠梗阻发生率及腹腔感染情况，统计并进行评估比较。

2 结 果

2.1 大鼠24 h一般情况比较腹部手术组、背部手术组大鼠造模手术操作均成功。正常对照组大鼠精神状态佳，食量正常，大便呈颗粒状；腹部手术组大鼠术后出现精神萎靡，活动倦怠，食量明显减少，大便较稀，体重减轻，术后有3只大鼠伤口出现渗液情况,其中有2只鼠存在腹部膨隆表现。背部手术组大鼠造模后精神状态良好，活动稍减弱，食量无明显变化，大便呈颗粒状，未出现腹部膨隆及伤口渗血情况。

2.2肾功能的测定与正常对照组比较，腹部及背部手术组大鼠血清肌酐、尿素氮水平明显增高(P<0.05)。见表1。

表 1 各组大鼠血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平的比较

2.3血清IL-6、TNF-α表达水平检测与正常对照组比较，腹部和背部手术组血清中IL-6、TNF-α 表达水平明显升高(P<0.05)，与腹部手术组比较，背部手术组大鼠炎症因子表达水平较低(P<0.05)。见表2。

表 2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α表达水平的比较

2.4肾系数的测定与正常对照组比较，腹部和背部手术组大鼠肾系数值显著增加(P<0.05)，见表3。

表 3 各组大鼠肾系数的比较

2.5肾组织病理学观察镜下观察发现手术组肾小管上皮组织肿胀明显，大量肾小管上皮细胞萎缩、坏死溶解改变，管腔扩张程度明显，组织间质水肿，左、右肾损伤程度基本一致，而正常对照组肾小管上皮细胞无形态病理学改变，细胞无肿胀变形、坏死。见图1。

①正常肾小球； ②正常肾小管上皮细胞； ③萎缩、坏死的肾小管上皮细胞； ④扩张的肾小管

2.6双肾组织肾小管坏死半定量评分的测量计算与正常对照组比较，腹部及背部手术组肾小管坏死评分明显增高(P<0.05)，左、右肾组织肾小管坏死评分结果趋势基本一致。见图2。

与正常对照组比较，*P<0.05

2.7术后30 d大鼠一般情况比较正常对照组大鼠无异常情况，背部手术组大鼠术后清醒基本正常饮食水，精神无异常，活动较正常对照组稍微减弱，食量基本正常，伤口恢复良好；腹部手术组大鼠术后24 h无明显进食现象，饮水量较少，精神一般，活动较正常对照组明显减弱，粪便形状稀，伤口恢复相对较差，部分大鼠伤口出现红肿现象，其中2只出现渗液等情况。腹部手术组大鼠在术后9 d左右体重一直呈下降趋势，背部手术组在术后3 d内体重呈轻微下降后出现体重增加趋势，对照组体重一直呈上升趋势，见图3。

图 3 术后各组大鼠体重变化折线图

2.8术后30 d大鼠存活率、肠梗阻发生率及腹腔感染率比较术后30 d背部手术组大鼠存活率明显高于腹部手术组(P<0.05)，在造模术后腹部手术组中分别在术后第2、3、7天发现大鼠死亡，其中术后第2和第3天共出现2只大鼠因发生肠梗阻现象死亡，还有2只大鼠在术后第7天因出现肠梗阻合并严重腹腔感染死亡，见表4。

表 4 各组大鼠30 d存活率、肠梗阻发生率及腹腔感染率比较(%)

3 讨 论

急性肾缺血再灌注损伤是导致急性肾损伤的主要原因之一，其机制复杂，成功地构建模型是实验研究成功的第一步。常见的建模方式包括单侧或双侧夹闭肾动脉、夹闭双侧肾动脉和静脉、单侧夹闭肾动脉或肾动静脉并切除对侧肾[9-11]，急性肾缺血再灌注造模缺血时间大多数控制在30～60 min之间，当缺血时间少于30 min则肾能够迅速代偿增殖来恢复其功能，当缺血持续时间超过60 min可能会导致急性肾小管坏死和肾衰竭[12]。我们团队前期通过多次反复实验，确定结扎肾动静脉时间最佳时间点为45 min[13]。有学者发现单纯阻断肾静脉组较单纯阻断动脉组肾功能严重受损，表现为肌酐水平升高，炎症反应增强，其静脉阻断后，肾微血管面临高动脉压，导致毛细血管壁破裂和出血，从而引起比较严重的肾损伤[14]。而夹闭肾动静脉受损程度相对于单纯肾动脉组较重，但同时不会出现静脉组这样严重的受损情况。结扎大鼠肾动静脉相对于单纯结扎肾动脉模型更加稳定，单纯结扎肾动脉模型肌酐水平会在术后复灌24 h出现峰值性后出现快速下降情况，而结扎肾动静脉组模型肌酐水平在术后复灌72 h内未出现明显下降趋势，给药物研究提供更长时间、更稳定、更可靠的药效平台[15]。

本研究在该基础上探讨手术入路途径的改良，更深一步完善模型的构建，实验从大鼠背侧入路建立急性肾缺血再灌注损伤模型，更好避免腹侧手术带来的手术压力等不良影响。IL-6和TNF-α 是诱发早期炎症反应的主要因子[16]，实验发现经背部及腹部手术组炎症因子表达水平明显升高，但经背部组炎症因子表达水平相对经腹部组明显降低。对比各组大鼠术后状态，发现背部手术组术后一般情况明显较腹部手术组改善，术后饮食水基本无影响，3d基本恢复良好，体重呈平稳上升的趋势，而背部手术组出现明显饮食不佳、精神状态差等系列问题，考虑手术影响胃肠道功能，术后各组大鼠予以蒸馏水灌胃模拟常规给药方式干预，发现背部手术组大鼠存活率明显高于经腹部组，死亡原因主要是由肠梗阻和腹腔感染所致。因此，我们认为经背部手术途径较腹部途径有以下主要优势：①经背部组手术切口长度小，且切口位置位于背部，感染因素较少，伤口愈合快；②大鼠肾位置位于后腹腔间隙，经背部手术途径能更快进入该区域并能清晰找到双肾及肾蒂结构，不需要拨动腹腔内的肠管及其他脏器，对肠管功能基本没有影响，保障了术后对动物模型的进一步观察研究；③由于肾蒂的位置更靠近背侧，手术造模需预留一定的空间放置微型动脉夹进行夹闭肾动静脉，从背部途径在不牵扯肾的情况下即可轻易、方便的分离出肾蒂，并可以清晰看到肾动静脉；④经背部组大鼠术后一般状态良好，不影响动物饮食水，不会导致营养不良、免疫力下降等情况影响实验结果。⑤经背部组大鼠造模后病理损伤程度基本同腹部组一致，但体内炎症水平相对较轻，在充分保证模型质量的同时降低死亡率，节约实验成本，也更符合动物“3R”原则。