cGAS-STING通路的调控机制及其相关药物研究进展

张旭飞，吴秀文综述，任建安审校

0 引 言

病原微生物感染宿主释放的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和细胞损伤释放的损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)一直是固有免疫研究中的热点[1-2]。模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)是固有免疫中不可或缺的成分，可识别PAMPs和DAMPs，激活固有免疫，诱导炎症因子或趋化因子的分泌，故PRRs在监测病原微生物的入侵和组织细胞的损伤中起到关键作用[3]。早期的研究已对细胞表面的PRRs进行了详细阐述。然而，近年来细胞内PRRs在病原微生物识别系统中的作用越来越受到重视。

鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)、干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)均是细胞内PRRs。cGAS可识别并结合细胞质内的双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)，激活状态的cGAS可将三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)合成2′3′-环化鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)。2′3′-cGAMP可直接激活内质网上的STING蛋白，STING激活后由内质网向高尔基体上转移[4]。激活的STING在高尔基体上招募并激活TANK结合激酶1 (TANK binding kinase 1，TBK-1)。一方面，TBK-1可直接激活NF-κB信号通路，诱导炎症因子的产生；另一方面，TBK-1招募并磷酸化下游干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)，磷酸化的IRF3可入核启动干扰素相关基因的表达，促进Ⅰ型干扰素的合成，从而增强免疫反应[5]，见图1。此外，cGAS-STING通路还参与调控细胞代谢、自噬、死亡，在肠道炎症、非酒精性脂肪肝、胰腺、肾纤维化等损伤中发挥着作用[6]。故调控cGAS-STING通路对于组织细胞内稳态的维持、相关疾病的治疗具有重要意义。本文针对cGAS-STING通路中各环节的干预机制及相关药物作一综述。

图 1 STING通路及其调控机制和药物

1 cGAS的调控

cGAS是细胞质内dsDNA的感受器，cGAS与dsDNA结合后，cGAS催化位点的构象由无序变为有序。最新的研究发现，cGAS激活后会形成二聚体，cGAS二聚体与外侧两条dsDNA形成梯形结构，并促进后续cGAS二聚体与两条dsDNA结合，dsDNA的链越长，结合的cGAS二聚体则越多，故cGAS的激活数量是取决于dsDNA的长度[7]。我们发现，给予盲肠结扎穿孔的小鼠腹腔注射脱氧核糖核酸酶Ⅰ，会明显减少造模小鼠血循环线粒体DNA和炎症因子含量，改善脓毒症介导的肠道损伤[8]。此外，线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)或高迁移率族蛋白1(High Mobility Group Box 1，HMGB1)参与装配cGAS-dsDNA形成的梯形结构，促进cGAS的激活[7]。所以促进细胞质内dsDNA的降解，减少细胞质内TFAM、HMGB1的释放可从根本上抑制cGAS-STING通路的始动环节。

1.1cGAS的抑制剂Hall等[9]发现一种具有生物活性的小分子PF-06928215可抑制cGAS活性，并且这种试剂本身对细胞活性影响很小。深入研究发现，PF-06928215可结合于cGAS的活性位点，这种结合可能会影响ATP与cGAS的结合以及下游cGAMP的合成。既往已发现羟化氯喹、奎纳克林等抗疟疾药物具有抑制cGAMP合成的作用，但深入研究发现这些药物作用机制并不是与cGAS活性位点结合，而是与细胞质内DNA结合，从而阻止了DNA与cGAS的结合[10]。据此，An等[11]设计、合成了一种类抗疟疾药物，命名为“X6”，能够阻止DNA与cGAS的结合，并且X6对cGAS-STING通路的抑制作用要强于羟化氯喹。suramin是WHO推荐治疗河盲症和非洲昏睡病药物清单上的基本药物。最近，Sintim团队通过筛选分析发现suramin是潜在的cGAS抑制剂，其作用机制较为独特，能够将dsDNA从cGAS解离下来，减少cGAMP的生成，缓解cGAS-STING通路的激活，降低Ⅰ型干扰素的合成[12]。

1.2cGAS的转录后修饰cGAS转录后修饰可调控cGAS的活性。2015年，Seo等[13]发现Akt激酶可通过磷酸化cGAS的Ser291或Ser305位点抑制cGAS的酶活性，给予Akt1/2特异性抑制剂Ⅷ或突变该磷酸化位点可促进dsDNA诱导的干扰素合成释放。此外，cGAS的泛素化修饰亦可调控cGAS的活性。RNF185是一种E3泛素化连接酶，在单纯疱疹病毒-1感染细胞期间，RNF185可于cGAS的K173和K384位点上介导K27泛素链形成，促进cGAS的酶活性；而沉默RNF185可抑制cGAS的酶活性，限制干扰素应答效应[14]。TRIM56也是一种E3泛素化连接酶，早期研究认为TRIM56是通过泛素化STING蛋白促进STING通路激活，然而后期发现TRIM56的敲除并不影响cGAMP直接激活STING。有研究深入探索，发现TRIM56是通过介导cGAS的K335位点泛素化，促进cGAS二聚化以及cGAMP的产生，加强cGAS-STING通路[15]。尽管如此，cGAS的活性是否受泛素-蛋白酶体系统的其他成分动态调控仍是一个有待解决的问题。

2 STING的激动剂和抑制剂

STING是位于内质网上的跨膜蛋白。在人STING蛋白结构中，其N末端有5个跨膜结构域，C末端是TBK1/IRF3连接结构域，此外还有一段CDNs连接结构域[16]。虽然STING激活后通过NF-κB、IRF3通路诱导炎症反应，损伤组织器官，但这种免疫应答亦可介导免疫防御，抵抗病原微生物感染，或监测肿瘤来源的dsDNA，产生固有的抗肿瘤免疫。除了经典通路，STING也有许多非经典通路。最新的研究发现，STING被激活后，其TM5、TM2结构域负责招募并激活NLRP3炎性小体，促进抗病毒反应[17]。

2.1STING的核苷酸类激动剂环化二核苷酸(cyclic dinucleotides，CDNs)是STING的直接激动剂。在经典通路中，cGAS产生的是2′3′-cGAMP，2′3′-cGAMP也是CDNs的一种。而在细菌感染宿主细胞过程中，会释放其他种类的CDNs，如2′2′-cGAMP、3′3′-cGAMP、c-diAMP以及c-diGMP[5]。这些环化二核苷酸可直接激活STING，诱导STING相关免疫应答。尽管CDNs种类众多，但既往研究发现cGAMP激活STING诱导Ⅰ型干扰素产生的能力高于c-diAMP和c-diGMP[18-19]；但在cGAMP中，2′3′-cGAMP结合STING的能力更强，诱导干扰素产生的能力也更强[18-19]。为对抗STING的激活，细胞内存在水解2′3′-cGAMP的固有机制。核苷酸外焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1，ENPP1)是一种跨膜糖蛋白，位于细胞膜和内质网膜中，在人体中广泛表达，包括胃肠道、肺、肝、脂肪组织等。研究发现ENPP1可将细胞外和细胞内2′3′-cGAMP水解成AMP和GMP，从而抑制2′3′-cGAMP激活STING[20]。此外，ENPP1的催化结构域中含两个锌离子结合位点，并且锌离子与ENPP1的水解活性密切相关[21]。

尽管CDNs是STING的直接激动剂，但单纯的CDNs实际利用起来有诸多缺点，如：稳定性差、细胞膜穿透性较差等。鉴于此，许多研究致力于CDNs的修饰，从而改善CDNs的性能。CDNs修饰的方法有很多，如为对抗磷酸酶可进行硫代磷酸化修饰、为增加膜穿透性可进行脂肪酸/氟修饰、为改善与STING的结合能力可进行核苷酸替换等，修饰的位点常在于磷酸二酯键的部位以及2′3′-OH部位[22-24]。尽管修饰可改善CDNs部分性能，但也可能会影响CDNs对STING的激活能力。

2.2STING的非核苷酸类激动剂为克服CDNs的缺点，也为适合工业化生产和低成本保存的需求，许多团队试图寻找取代CDNs的分子。当前，主要有6种STING的非核苷酸类激动剂：5,6-二甲基黄体酮-4-乙酸(5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA)、黄酮乙酸(flavone acetic acid，FAA)、10-羧甲基-9-吖啶酮(10-carboxymethyl-9-acridanone，CMA)、α-倒捻子素(α-Mangostin)、BNBC以及[25-30]。在以上6种分子中，并不是全部都对人类STING蛋白有效，只有α-倒捻子素、BNBC、diABZ能够激活人类STING蛋白；此外，只有BNBC对鼠STING无效，其余5种都对鼠STING有效。

DMXAA和FAA是黄酮类化合物，它们被发现可通过破坏肿瘤血管系统和诱导细胞因子分泌来抑制小鼠模型下的黑素瘤、胶质瘤以及非小细胞肺癌[26,31-32]。Zhang等[29]发现α-倒捻子素对人类STING的激活能力要强于鼠STING。此外，α-倒捻子素干预后，能促进巨噬细胞向M1型转变，而M1型巨噬细胞可参与抗肿瘤免疫[29]。Ramanjulu等[25]通过高通量筛选发现diABZI能够与cGAMP竞争结合于STING上，并且diABZI与STING的结合亲合力是2′3′-cGAMP的18倍，同时diABZI激活STING诱导干扰素产生的效果亦强于2′3′-cGAMP。改良后的diABZI在静脉注射后对CT26结直肠肿瘤有显著的抑制作用作用[25]。尽管上述6种STING激动剂相比于CDNs，具有较强的稳定性、适合商业化生产，但细胞膜穿透性仍较差。

2.3STING的抑制剂近年来，关于STING抑制剂的研究主要围绕STING的棕榈酰化。在2016年，Mukai等[33]发现STING激活后从内质网转移到高尔基体上，并在高尔基体上发生棕榈酰化，其棕榈酰化位点是位于STING半胱氨酸88/91上。STING发生棕榈酰后，能够促进STING的二聚化形成，招募下游TBK1。故STING的棕榈酰化修饰对于STING下游的激活至关重要。2018年，Haag等[34]通过筛选发现两种硝基呋喃衍生物(C-176、 C-178)能够明显抑制干扰素的应答，其机制是抑制STING半胱氨酸91位点的棕榈酰化；但C-176、 C-178只能抑制鼠STING，对人STING无效。研究者又根据C-176、C-178结构，得到另两种衍生物——C-170、C-171。C-170和C-171亦可抑制STING半胱氨酸91位点的棕榈酰化，并且C-170和C-171可同时抑制人STING和鼠STING。此外，研究者也筛选出另一种衍生物H-151，通过同样机制负调控人STING和鼠STING。同年，Hansen等[35]发现3种硝基脂肪酸——硝基共轭亚油酸、9-硝基油酸和10-NO2-OA，这3种硝基脂肪酸可抑制STING半胱氨酸88/91位点的棕榈酰化，同时抑制人STING和鼠STING。

STING也存在一些竞争性抑制剂。2018年，Li等[36]从环肽数据库里筛选出了能抑制cGAS-STING通路的Astin C，其为从药用植物紫菀中提取的环肽。研究发现Astin C可结合于STING的C末端结构域，从而抑制IRF3的招募[36]。并且给予Astin C可显著缓解小鼠Trex1敲除所诱导的自发性炎症反应[36]。2019年，Siu等[37]通过自动配体识别系统，筛选出Compound 18。Compound 18可连接STING结构域上cGAMP结合的位点，抑制STING的激活；并且Compound 18具有较好的口服生物利用度。

2.4STING的转录后修饰2013年，Konno等[38]发现cGAS产生的2′3′-cGAMP除可直接激活STING外，也可通过负反馈轴介导STING的磷酸化，抑制干扰素应答。具体机制而言，cGAMP可使腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase，AMPK)去磷酸化，去磷酸化的AMPK丧失了对UNC-51样激酶(UNC-51-like kinase，ULK1)的抑制作用。活化的ULK1可磷酸化STING的S366位点，从而抑制STING介导的干扰素应答效应。值得注意的是，活性抑制的STING将通过自噬途径被细胞降解。

STING的泛素化修饰也参与调控下游的活性。线粒体E3泛素蛋白连接酶(mitochondrial E3 ubiquitin protein ligase 1，MUL1)可催化STING的K224位点发生泛素化，STING的泛素化参与调控IRF3的招募与激活[39]。而阻断K224位点的泛素化可明显抑制IRF3介导的干扰素表达，但不影响NF-κB通路的激活[39]。此外，有研究发现使用泛素蛋白特异性蛋白酶13(ubiquitin-specific protease 13，USP13)可使STING去泛素化[40]。去泛素化的STING 招募TBK1的能力大大减弱，从而抑制了炎症反应[40]

3 TBK1的调控

TBK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，并且是STING的关键下游，STING通过招募TBK1可介导NF-κB、IRF3激活。在经典通路中，cGAS-STING-TBK1介导的下游激活更偏重于IRF3通路[41]。但在依托泊苷诱导的核损伤中，共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM) 和干扰素γ诱导因子16(interferon-g-inducible factor 16，IFI16)共同介导STING-TBK-1的激活，此时的TBK1主要激活的是NF-κB通路[42]。目前，TBK1对两种下游的选择机制尚不清楚。故在不同方式激活STING的过程中，抑制TBK1可能会有不同的效应。

据报道，BX795是TBK1/IKKε通路强力的抑制剂[43]。也有研究发现，使用BX795治疗原代外周血单核细胞(来源于STING基因突变、干扰素效应阳性的儿童患者)，治疗后可明显抑制IRF3的磷酸化以及干扰素的产生[44]。Mclever等[45]设计合成了4-二氨基-5-环丙基嘧啶，这种分子能够弥补BX795的部分性能以及激酶选择性。2019年，Thomson等[46]发现了GSK8612是一种强效、高选择性TBK1抑制剂，并且具有较好的细胞膜穿透性。研究者使用dsDNA或cGAMP刺激THP1细胞，给予GSK8612治疗后可明显抑制干扰素的产生。值得注意的是，如果长期使用TBK1抑制剂，可能会导致抗病毒免疫缺陷，增加感染病毒的风险。

4 结 语

cGAS-STING通路参与多种疾病的发生发展，阻断cGAS-STING通路可抑制炎症反应、减轻组织损伤，而激活cGAS-STING通路可促进抗病毒、抗肿瘤效应。了解cGAS-STING通路各环节的调控机制，可利用现有的药物或研发新药物干预cGAS-STING通路，为临床相关疾病治疗提供新的思路和方法。随着研究的深入，cGAS下游不依赖STING、STING上游不依赖cGAS以及STING下游不依赖IRF3等非经典cGAS-STING通路逐步被发现，使得关于该通路的调控位点的研究更引人入胜。