调节神经元CREB磷酸化水平对APP和γ分泌酶的影响

邸畅 李国萍 罗浩丹 毕珊 孙欣 陈绍春，3

(昆明医科大学 1基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，云南 昆明 650500；2第三附属医院头颈外科；3康复学院)

γ分泌酶复合体是阿尔茨海默病(AD)中形成β淀粉样蛋白(Aβ)的关键酶，它通过对β分泌酶切割Aβ前体蛋白(APP)形成的含有99个氨基酸的C端片段(C99)再切割形成Aβ〔1〕。而γ分泌酶复合体中起主要催化作用的部分是早老素(PS)1蛋白，PS1在早老素增强子(PEN2)的存在下会被水解为两段而发挥对C99的剪切作用〔2〕。当用抑制剂γ-分泌酶抑制剂抑制γ分泌酶的功能时，PS1的表达量反而升高〔3〕。环磷酸腺苷(cAMP)反应原件结合蛋白(CREB)一直认为是形成和维持长期记忆的关键蛋白，它的表达量及磷酸化水平一直被作为记忆能力变化的指标，而在AD中长期记忆的丧失是患者生活不能自理的重要原因〔4〕。Aβ以单体形式存在可以增加CREB的产生，而Aβ产生的低聚物及老年斑是破坏神经元导致痴呆的重要原因〔5〕。Aβ1～40与Aβ1～42的比例失衡被认为是导致淀粉样变性及老年斑的关键原因〔6〕。当突变激活CREB的上游基因启动子表达，CREB的表达量上升的情况下，PEN2蛋白的表达量随之上升〔7〕。而抑制蛋白激酶(PK)A-CREB-脑源性神经营养因子(BDNF)通路时大鼠表现出长期的空间学习和记忆障碍〔8〕。既往研究多将CREB作为评价记忆能力变化的分子指标，而很少将其作为AD发生发展和防控的初始因素进行研究。本文旨在通过使用CREB激动剂和抑制剂干预CREB在人神经元样细胞株SY5Y中的磷酸化水平，探讨CREB磷酸化水平的变化对APP及γ分泌酶复合体的影响。

1 材料与方法

1.1材料 DMEM 培养基、胎牛血清、F12培养基购自美国Gibco公司； 0.25%胰蛋白酶、青-链霉素购自美国Hyclone公司；Forskolin和H 89 2HCL购自美国CST公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 空载体SY5Y细胞株(Vector-SY5Y)、过表达Gαq的SY5Y细胞株(Gαq-SY5Y)、过表达APP的SY5Y细胞株(APP-SY5Y)委托上海汉恒生物科技有限公司构建，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养，培养条件为37℃、5%CO2浓度。

1.2.2CREB激活/抑制实验 cAMP激动剂Forskolin激活CREB的磷酸化，用PKA抑制剂H 89 2HCL抑制CREB的磷酸化，根据产家的操作指南和推荐浓度，用二甲基亚砜(DMSO)完全溶解Forskolin和H 89 2HCL，分别控制实验的终浓度Forskolin为35 μmol/L、H 89 2HCL 为30 μmol/L。用25 ml培养瓶培养细胞至70%汇合度，弃除培养液，分别加入含H 89 2HCL(30 μmol/L)的培养液、单纯培养液、含Forskolin(35 μmol/L)的培养液2 ml至不同组细胞，继续培养12 h，收集细胞提取蛋白进行后续实验。

1.2.3Western印迹实验 收集细胞，加入RIPA裂解液于冰上裂解10 min，10 000 r/min、4℃离心30 min后取上清即为细胞总蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白质的浓度。取30 μg总蛋白于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶中电泳分离，之后转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h。1∶1 000稀释的兔抗人CREB、p-CREB、PEN2、PS1-CTF、APP、GAPDH等抗体(均购自CST公司，美国)并于4℃孵育PVDF膜12 h，1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h，采用化学发光成像系统成像。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件行t检验。

2 结 果

2.1在Vector-SY5Y细胞中应用CREB激动剂和抑制剂之后有关蛋白水平比较 与对照组比较，激动剂组中总CREB、APP的表达无明显差异，p-CREB、PEN2、PS1-CTF的表达明显上调(P<0.05)；抑制剂组中总CREB、PEN2、PS1-CTF变化不明显，APP的表达明显上调，p-CREB明显下调(P<0.05)，见表1、图1。

2.2在Gaq-SY5Y细胞中应用CREB激动剂和抑制剂之后有关蛋白水平比较 与对照组比较，激动剂组中总的CREB水平无明显变化，p-CREB、PEN2表达量明显上调，APP及PS1-CTF明显下降(P<0.05)；抑制剂组中总的CREB、PS1-CTF水平均无明显变化，p-CREB、PEN2、APP表达明显下降(P<0.05)，见表1、图2。

图1 Vector-SY5Y细胞使用CREB抑制剂与激动剂处理后有关蛋白表达

2.3在APP-SY5Y细胞中应用CREB激动剂和抑制剂之后有关蛋白水平比较 与对照组比较，激动剂组中总CREB、APP变化不明显，PS1-CTF表达明显下降，p-CREB、PEN2表达明显上调(P<0.05)；抑制剂组中总CREB表达量明显增加，p-CREB变化不明显，PEN2表达明显下降，PS1-CTF、APP表达量明显上升(P<0.05)，见表1、图3。

图2 Gaq-SY5Y细胞使用CREB抑制剂与激动剂处理后有关蛋白表达

图3 APP-SY5Y细胞使用CREB抑制剂与激动剂处理后有关蛋白表达

3 讨 论

CREB在大脑所有细胞中都有表达，CREB参与学习和长期记忆的形成，是作为转录因子发挥作用的蛋白质家族中的一员。转录因子(如CREB)对启动转录耦联起着至关重要的作用，其将发生在细胞膜上的事件传递至细胞核并引起基因表达的改变〔9〕。CREB转录因子家族的成员包括转录增强子(CREB 1)和抑制子(CREB 2)，并与许多信号蛋白相互作用，介导从短期记忆到长期记忆的转变〔10〕。AD 是最常见的痴呆类型，占所有痴呆患者 60%～80%〔4〕。

Aβ的聚集和沉积不仅会破坏突触结构和功能，也会导致神经细胞凋亡，从而导致记忆和认知功能障碍〔11〕。在AD模型Tg2576基因突变小鼠脑组织免疫组化分析显示海马和皮层CREB水平降低。转基因小鼠脑组织中检测到氧化应激标志物，显示星形胶质细胞丰富的区域CREB染色减少〔12〕。在AD患者死后海马标本中，Aβ与CREB蛋白水平也呈负相关，由此可见CREB在AD中是减少的〔13〕。用福斯克林激活CREB(使其磷酸化)，可显著促进PEN2 的mRNA转录和蛋白的表达，而对γ-分泌酶复合物的其他组分没有影响〔7〕。当PS-1基因突变导致PS-1和PEN2联系减少，Aβ42/Aβ40比例升高，但不影响γ分泌酶的功能和PS-1的内分解，也不影响Notch信号通路，即当PEN2表达量降低时Aβ42/Aβ40比例升高〔14〕。而在痴呆小鼠模型中使用γ分泌酶抑制剂，加重了小鼠的记忆障碍〔15〕。这也从侧面说明了Aβ42可能在记忆形成中具有重要作用。

基于CREB在长期记忆形成中的重要作用及γ分泌酶复合体重要成分PS1、PEN2在Aβ生成和AD发生发展中的重要角色，且诸多文献显示CREB的改变在AD的发病中一直是作为记忆力变化的指标，而CREB的减少到底是因还是果却没有具体的研究表明。本研究结果说明，CREB不仅可以作为记忆力变化的指标，也可能是AD防治的重要靶点。Gαq蛋白是异源三聚体 G 蛋白 α 亚基中的一种，在大脑内广泛表达。课题组前期研究发现，在 SAMP8 早衰小鼠脑皮质中，Gαq 随着小鼠年龄的增长而减少〔16〕，这提示 Gαq 的表达水平与脑衰老相关。进一步研究发现，SY5Y 细胞中过表达 Gαq 发挥了明显的抗氧化损伤作用〔17，18〕。本研究结果提示Gαq能与外源性CREB激活剂协同作用，从源头上减少APP的生成。