滇重楼茎组织内生细菌的分离、鉴定及促生菌筛选

张鹏，刘婷，苗莉云，裴婷，甘喆，耿红*

(1 中南民族大学 生命科学学院，武汉430074；2 山西中医药大学 基础医学院，晋中 030619)

内生菌具有促进宿主植物生长和药用物质合成的作用[1-2].重楼(Parispolyphylla)为百合科重楼属多年生草本植物，块状根为主要入药部分，一般需5年以上才可入药.重楼的叶和茎为一年生，资源丰富，可作为根的替代资源开发皂苷类药物[3].分析重楼不同组织的内生菌多样性以及从中筛选促生菌株，有助于揭示内生菌对宿主生长发育的影响以及利用内生菌改良重楼种植技术.王茜[4]等发现滇重楼不同组织的内生细菌组成差异较大.廖秋红等[5]从6年生滇重楼全株组织(叶，茎，根状茎)共分离到49株内生细菌，其中茎组织分离到9株，归属于2属5种，其优势菌为芽孢杆菌属(80.0%).周先治等[6]从4年生华重楼植株的根、茎、叶共分离到65株内生细菌，归属到11属23种，其中健康植株的茎中分离到10种内生细菌，其优势菌为芽孢杆菌属(67.1%)；病株茎中分离到8种内生细菌，优势菌为假单胞菌(50.3%).同时，宋发军等[7]从重楼内生细菌中筛选获得多株可促进小麦种子萌发的菌株.

本文通过分离滇重楼茎组织的可培养内生细菌以及分析各个内生细菌的16S rDNA序列，初步揭示其茎组织中内生细菌多样性、菌群结构及其优势类型；并通过与小麦幼苗的共培养筛选促生菌，为利用内生菌改良重楼种植技术的研究提供菌种资源.

1 材料与方法

1.1 材料

5年生滇重楼植株于2018年5月采集自云南省丽江市古城区七河镇万农生物科技有限公司的种植基地.牛肉膏蛋白胨培养基、LA和LB培养基用于内生细菌的分离和培养，1/2 PDA培养基用于共培养实验，27F和1492R引物用于内生细菌16S rDNA序列的扩增[8].

1.2 内生细菌的分离与纯化

方法参照文献[8-9]，新鲜重楼茎组织冲洗干净后，依次采用70%乙醇、1%次氯酸钠、75%乙醇各2 min，进行表面消毒，无菌水冲洗5 min后，于无菌条件下剪取0.1 g茎，加入1 mL生理盐水，轻柔研磨成悬浮液，适当稀释后涂布在分离培养基上，28 ℃培养7 d.培养过程中，不断挑取新长出的菌株至新的培养基.之后通过划线法纯化获得各个内生细菌的单克隆.

1.3 内生细菌的多样性分析

方法参照文献[8]：将各个内生细菌分别接种到5 mL LB培养基，28 ℃、200 r/min培养至OD600为0.5～0.6时，取0.5 μL菌液做模板，采用27F和1492R引物扩增其16S rDNA序列.扩增条件：95 ℃ 10 min；93 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 10 min.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序.各内生细菌的16S rDNA序列分别进行BLAST比对，确定其分类，再用Megan软件选择Neighbor-joining方法构建系统发育树.

1.4 促生菌的筛选

方法参照前期报道[8].取5 μL OD600为0.5～0.6的内生细菌培养物加入适量培养基混匀后，均匀涂布在1/2 PDA培养基上，并分别接种表面消毒处理的小麦种子10粒；对照组为相同数量的小麦种子接种在不涂布内生细菌的1/2 PDA培养基.共培养条件为28 ℃、14 h光照/10 h黑暗培养20 d.随机选取小麦幼苗，测量其株高、根长、根的数目、鲜重，将导致共培养幼苗的株高增长率≥30%、根长增长率≥30%的内生细菌定义为促生菌，增长率=(A-B)/B，其中A为与供试菌株共培养小麦的株高或根长，B为对照组小麦的株高或根长.所有实验均为5个生物学重复.

2 结果与讨论

2.1 内生细菌的分离、纯化

将茎组织研磨液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨和LA培养基上，培养过程中不断分离新长出的细菌，并通过多次划线纯化最终得到128株细菌.同时，为验证表面消毒方法的效果，本研究也将最后一次清洗茎组织的无菌水涂布在上述培养基上，28 ℃培养5～7 d后培养基上依然无细菌生长，说明所用表面消毒方法可以有效去除茎组织表面的细菌，因此，本研究所得细菌为来源于茎组织的内生细菌.

2.2 内生细菌的多样性分析

16S rDNA序列分析结果表明，这些内生细菌归属于3个门(放线菌门、厚壁菌门、变形菌门)，其中厚壁菌门是优势门，占比(比例=目标分类单元的数量/对应分类单元的总数量)82.8%；4个纲(α变形杆菌纲、丙型变形菌纲、杆菌纲、放线菌纲)，其中杆菌纲是优势纲，占比为82.8%；6个目(黄单孢菌目、假单胞菌目、乳杆菌目、杆菌目、微球菌目、鞘脂单胞菌目)，其中杆菌目为优势目，占比为77.3%；11个科(黄单孢菌科、假单胞菌科、莫拉氏菌科、鞘脂单胞菌科、肉杆菌科、气球菌科、类芽孢杆菌科、芽孢杆菌科、微球菌科、微杆菌科、亮杆菌科)，其中芽孢杆菌科是优势科，占比为75.8%；14个属(寡养单胞菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、鞘脂单胞菌属、肉食杆菌属、气球菌属、类芽孢杆菌属、奇异假芽孢杆菌属、芽孢杆菌属、微球菌属、节杆菌属、微杆菌属、亮杆菌属、类节杆菌属)(图1)，其中芽孢杆菌属是优势属，占比75.0%，而寡养单胞菌属、假单胞菌属、鞘脂单胞菌属、肉食杆菌属、奇异假芽孢杆菌属、节杆菌属、亮杆菌属是劣势属，占比均较低(图2).

图1 基于16S rDNA序列的滇重楼茎中内生细菌的多样性分析

图2 滇重楼茎中内生细菌的属水平的分类

值得注意的是本研究分离内生细菌数量明显高于文献报道的华重楼[6]和滇重楼[5].可能原因之一是与植物材料的种植地区及生长年限有关，本研究的重楼材料是5月份采集自云南丽江的5年生植株，而周先治等[6]的华重楼材料是6月份采集自福建崇仁的4年生植株，廖秋红等[5]的滇重楼材料是10月份采集自大理弥渡的6年生植株.另一个可能原因是与使用重楼材料的数量及内生细菌的分离方法有关，本研究是将0.1 g茎组织轻柔研磨后，适当稀释，并全部涂布于两种培养基进行内生细菌的分离；而廖秋红等[5]将重楼组织磨碎后，转移到5 mL LB培养基并在37 ℃、180 r/min培养2 h～3 h，对培养物进行稀释并取100 μL稀释液涂布在LB平板培养基上进行内生细菌的分离，但并没有提到用多少材料来进行内生细菌的分离；周先治等[6]将样品表面消毒后并充分研磨，无菌水稀释后，取200 μL稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨平板进行内生细菌的分离，但也没有说明用多少材料来进行内生菌的分离.

2.3 促生菌的筛选

将128株内生细菌分别与小麦幼苗共培养20 d，发现10株内生细菌可以与小麦幼苗共生长(部分结果如表1)，不引起小麦幼苗衰亡.但是，其中6株内生细菌的促生效果不明显，例如，菌株YNS31013与小麦幼苗共培养20 d后，其共培养小麦幼苗株高和根长的增长率分别是对照的26.1%和40%，其促进效果没有达到本文对促生菌的要求.

4株内生细菌的促生效果明显(表1).YNS21026和YNS21022对小麦株高的促进效果最好，与对照[(9.75±2.1)cm]相比，株高的增长率分别是87.2%和76.2%.YNS21026和YNS11005对小麦根长促进效果最好，与对照[(0.75±0.3)cm]相比，根长的增长率分别是 310%和167%.YNS21022和YNS21026对小麦鲜重增加效果最好，与对照相比，鲜重的增长率分别是105.4%和99.7%.而YNS32034对小麦幼苗的株高、根长和鲜重的促进效果，弱于YNS21026、YNS21022、YNS11005，但也达到本文对促生菌的要求，与其共培养的小麦幼苗的株高、根长的增长率分别是43.2%、119%.

表1 滇重楼茎中内生细菌对小麦幼苗的促生作用

芽孢杆菌、假单胞菌和类芽孢杆菌是常见促生菌.分离自拟南芥根部的芽孢杆菌(UCMB5033、UCMB5036、UCMB5113和FZB42)可促使拟南芥植株的鲜重增加约2倍[10].分离自土壤的芽孢杆菌(菌株A8、B5、C5 和C9)可诱导吲哚乙酸(IAA)相关基因的表达从而促进拟南芥的生长[11].分离自水稻根际的假单胞菌A15可促进水稻根干重增加5倍[12]；分离自废水的假单胞菌KUJM可产生吲哚乙酸(IAA)并增强扁豆种子发芽的潜力[13]；分离自花生根际土壤的类芽孢杆菌YZ29可产生铁载体和促进花生的生长[14],分离自忍冬的类芽孢杆菌菌株122和130可促进小麦根长增长10%[15].而本研究所获得的芽孢杆菌YNS21026和假单胞菌YNS21022分别促进小麦株高增长87.2%和76.2%；芽孢杆菌YNS21026和类芽孢杆菌YNS11005分别促进小麦根长增长310%和167%；假单胞菌YNS21022和芽孢杆菌YNS21026分别促进小麦鲜重增长105.4%和99.7%.这些促生菌株为深入研究内生细菌的促生机理以及进一步利用促生菌改良重楼种植技术的研究提供了菌种资源.

3 结语

本研究从云南丽江采集的5年生重楼的0.1 g茎中分离到128株内生细菌，其优势菌为芽孢杆菌属(75.0%).通过与小麦共培养所得4株促生菌中，芽孢杆菌YNS21026对小麦的株高、根长促进效果最好，增长率分别是87.2%、310%；假单胞菌YNS21022对小麦鲜重增加促进效果最好，增加率是105.4%.这些结果预示芽孢杆菌属和假单胞菌属的内生细菌与重楼茎组织的生长发育等关系紧密.