凤尾草乙醇提取物舒张小鼠气管平滑肌作用机理

沈金花，邱海婷

(中南民族大学 生命科学学院&医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北重点实验室，武汉 430074)

哮喘是一种常见的慢性气道炎症，常导致反复发作的喘息、气促、胸闷、咳嗽等症状，严重影响患者生活质量.全球哮喘报告显示，哮喘的发病率约为4.3%，这意味着全世界有大约3.34亿人患有不同程度的哮喘.预计到2025年，这一数字还将增长1亿人，变成4.34亿人[1].哮喘目前还无法根治，只能通过有效的管理实现对病情的控制.临床上已有多种药物可以用来治疗哮喘，这些药物主要是扩张支气管和抗炎抗过敏药.西药副作用比较多，病情易反复；而中药治疗哮喘历史悠久、经验丰富、方法独特，理论自成体系.

凤尾草(PterismultifidaPoir)为凤尾蕨科、凤尾蕨属的一种草本植物，又名井栏边草、山鸡尾、凤凰草等，全草入药，主要分布在我国南部地区，常生长在潮湿的地方，其功效主要是清热利湿、消肿止痛、抗菌消炎、凉血止血[2].凤尾草药理活性成分相关研究表明：凤尾草主要含有黄酮类、萜类以及苯丙素类物质[3]，它能减弱雷公藤甲素的毒性[4]，具有广谱的抗菌[5]、抗肿瘤[6]及保肝作用[7]等.目前尚没有关于凤尾草用于治疗呼吸系统疾病以及肌肉紧张相关疾病的研究报道.因此，本文以凤尾草乙醇提取物为材料研究其对小鼠气管平滑肌的作用及机理，旨在探索中药凤尾草的新功能及在治疗哮喘方面的作用机理.

1 材料与方法

1.1 实验材料

雄性BABL/c小鼠，SPF级，购自湖北省疾病预防控制中心，饲养在中南民族大学实验动物中心.无水乙醇、氯化钾(国药集团)；乙酰胆碱(上海源叶)；硝苯地平(Sigma)；生理盐水(武汉滨湖双鹤)；高钙液(physiological saline solution, PSS)、零钙液(0 Ca2+-PSS)、无钠溶液(Li-PSS)均参考文献[8]配制.

PHS-2F pH计、SZM体视显微镜、HV-4型离体组织器官恒温灌流系统、BL-420S生物机能实验系统(成都泰盟)；DZ-1A真空干燥箱(天津泰斯特)；FlexiVent肺功能仪(加拿大SCIREQ)；JH-2张力换能器(北京航天医学工程研究所).

1.2 实验方法

1.2.1 EEPM的制备

称取购自同仁堂的凤尾草500 g，用中药粉碎机研磨成粉末状后，用70%的乙醇以1∶7的固液比常温浸泡5～6 d，再将上清液真空抽滤，通过旋转蒸发仪60 ℃旋转蒸干乙醇，将提取物置于真空干燥箱中干燥至恒重，获得中药浸膏.每次取用时，用PSS配制成50 mg·mL-1待用.

1.2.2 小鼠离体气管环的获取

用断颈法处死小鼠后，腹部朝上，用蛙钉固定于解剖板上，喷洒75%酒精，用剪刀剪开小鼠腹部的皮肤和组织，打开胸腔，从喉结处垂直剪断气管，边用镊子提起气管，边剪去气管周围多余的组织，再将气管和肺放置于预冷的高钙液中.

1.2.3 张力换能器的调试与使用

打开张力换能器后，依次用酒精、超纯水、PSS将水浴槽洗涤3次，在每个水浴槽中加入6 mL PSS溶液，37 ℃温浴，通过空气泵向其中泵入空气.将分离的小鼠气管环与专用挂钩连接，挂于张力换能器上.调节气管初始前负荷为300 mg.平衡4次，每次15 min，每次平衡结束换液.平衡完成后，用80 mmol·L-1高钾溶液或100 μmol·L-1ACh溶液预刺激气管，待气管的收缩稳定后，换液洗脱至基线，让气管休息10～20 min，再开始正式实验.

1.2.4 Rrs的测量

小鼠称重后，注射1%戊巴比妥钠使其麻醉，用蛙钉将其腹部朝上固定于解剖板上，喷洒酒精，用小剪刀将颈部的皮肤和组织剪开，露出气管，在气管上剪出小的“T”型开口，将专用针头插入下方气管中，深度大约为4～5个气管环，用线将气管与针头系牢，再将小鼠通过专用的针头与肺功能仪相连.根据软件提示，通过雾化头给药，测定Rrs的大小.

2 结果

2.1 EEPM舒张高钾诱导预收缩的小鼠气管平滑肌

80 mmol·L-1KCl能引起小鼠气管的收缩，这是因为高K+使平滑肌细胞膜电位去极化，VDCCs通道被激活，胞外Ca2+内流，气管收缩[9].当收缩稳定后，向水浴槽中累积加入0.0316～10 mg·mL-1的EEPM，可见EEPM剂量依赖性地舒张由高钾引起的小鼠气管平滑肌的收缩(图1(a))，这种舒张程度达到了(95.14 ± 0.73)%(图1(b)).当EEPM浓度达到10 mg·mL-1时，气管舒张程度约为100%.通过图1(d)可见，EEPM对静息状态的小鼠气管环无影响.Nifedipine是VDCCs离子通道的特异性阻断剂，它可以完全舒张由高钾引起的气管环收缩(图1(c))，这提示EEPM可能是通过影响VDCCs通道发挥作用.

图1 EEPM对高K+预收缩的小鼠气管平滑肌的舒张作用

2.2 EEPM抑制高钾引起的Ca2+内流

在0 Ca2+的条件下，高K+的加入不会引起气管的收缩，当外界环境中Ca2+恢复时，因为外钙内流，气管产生持续的收缩，而加入EEPM能使这个收缩作用得到舒张(图2(a)).而且，在0 Ca2+条件下加入EEPM，即使再加入高K+，气管也只是产生了非常小幅度的收缩(图2(b))，这提示EEPM可能大幅度地阻断了外钙内流的途径.而高K+能激活VDCCs通道，VDCCs通道是外钙内流的主要途径.因此推测EEPM能舒张高K+预收缩的小鼠气管平滑肌是因为其影响了VDCCs通道而抑制了外钙内流.

图2 EEPM对高钾引起的Ca2+内流的抑制作用

2.3 EEPM舒张ACh引起预收缩的小鼠气管平滑肌

EEPM能够剂量依赖性地舒张ACh引起收缩的小鼠气管平滑肌.100 μmol·L-1ACh能使小鼠气管产生一个持续的收缩.而0.0032～10 mg·mL-1EEPM的累积加入能够使小鼠气管环的收缩得到抑制(图3(a)).当EEPM浓度达到3.7 mg·mL-1时，小鼠气管环舒张程度达到100%(图3(b)).

图3 EEPM剂量依赖性舒张ACh预收缩的气管平滑肌

2.4 排除VDCCs通道后EEPM舒张小鼠气管平滑肌

先加入VDCCs通道的特异性阻断剂Nifedipine，再加入3.7 mg·mL-1EEPM，可见EEPM仍能使预收缩的小鼠气管舒张(图4).这提示EEPM不仅影响VDCCs通道，还影响其他通道从而使ACh预收缩的小鼠气管舒张.

图4 阻断VDCCs通道后，EEPM对气管平滑肌的舒张作用

2.5 EEPM抑制ACh引起的内钙释放

ACh可以激活VDCCs通道和NSCCs通道，导致外钙内流和内钙释放[10].在0 Ca2+条件下，即使加入ACh，也只能使肌浆网中的Ca2+瞬时释放，气管无法产生持续性收缩.当外界Ca2+浓度恢复，外钙内流，内钙释放，气管产生一个持续的收缩.这种收缩能够被EEPM完全抑制(图5(a)).如果提前孵育EEPM，即使外界Ca2+浓度恢复，气管也无法发生收缩(图5(b)).这说明EEPM能够抑制外钙内流，内钙释放.为了更加深入地研究参与ACh引起的内钙释放的离子通道，利用Nifedipine阻断了VDCCs通道，在0 Ca2+条件下，加入ACh只能引起肌浆网Ca2+的瞬时释放，当环境中Ca2+浓度恢复后，外界钙可通过NSCCs通道进入细胞，内钙释放，气管仍能产生一个持续的收缩.这种收缩能够被EEPM完全舒张(图5(c)).接着选用2种可以阻断NSCCs中的TRP通道的阻断剂：Pyr 3和Gadolinium，可见这两种阻断剂均能部分舒张预收缩的小鼠气管，EEPM可以使余下的部分完全舒张(图5(d)).这说明NSCCs通道参与了ACh引起的内钙释放，而EEPM能够抑制ACh引起的内钙释放.

图5 EEPM对ACh引起的内钙释放的抑制作用

2.6 EEPM抑制Na+/Ca2+交换

NCX也是与Ca2+内流有关的一种离子通道.在PSS(含Na+)溶液中，ACh可以引起小鼠离体气管环的收缩(图6(a)).但将PSS的Na+用Li+替换掉(Li-PSS)，气管的基础张力有所上升，100 μmol·L-1ACh仍能使气管发生一定的收缩，加入EEPM后，小鼠气管舒张直至基础张力以下(图6(b)).两组实验小鼠气管的基础张力和收缩值均有显著的差异(P<0.01，图6(c)).以上实验结果表明：NCX也参与了小鼠气管环的收缩，但是EEPM能够作用于NCX通道，使收缩的小鼠气管舒张.

图6 EEPM对Na+/Ca2+交换的抑制作用

2.7 EEPM对气管组织活性的影响

为了探究EEPM对小鼠气管活性的影响，在气管预收缩稳定时，向其中加入10 mg·mL-1EEPM，使气管舒张.用PSS将EEPM洗脱下来，向槽中加入6 mL PSS以及100 μmol·L-1ACh或80 mmol·L-1KCl，观察气管的收缩幅度(图7(a)～图7(d)).可见加入ACh或KCl后，小鼠气管收缩无法恢复到原来的数值，并且两种激动剂的两次收缩值间均具有显著性差异(P<0.01).这可能是因为EEPM对小鼠气管活性有一定的影响，或者EEPM未洗脱干净，残留的药物影响了气管的收缩幅度.

图7(b)和图7(d)中，两组实验中未加入EEPM前与EEPM洗脱后的气管收缩值均有显著性差异，**P<0.01.

2.8 EEPM对Rrs的影响

为探究EEPM在活体上对Rrs的影响，利用肺功能仪对对照组和实验组小鼠的Rrs进行了检测，发现EEPM能够降低Rrs的上升(P<0.01，图8)，这提示了EEPM对哮喘的治疗也能发挥一定的作用.

图8 EEPM对小鼠呼吸气道阻力的影响

3 讨论

哮喘是一种异质性呼吸系统疾病，患者的临床表型不同，其诱因也是多种多样，包括先天遗传、肥胖、饮食、变应原、烟雾和空气污染等[11].近些年来，全球哮喘患者数量与日俱增，哮喘的治疗越来越受到人们的重视.治疗哮喘常用的药物为β受体激动剂、糖皮质激素、茶碱类药物、抗胆碱能类药物、炎性介质拮抗剂以及钙通道阻滞剂.但是，目前没有特效药能够治愈哮喘，因此针对哮喘的药物治疗机理的研究仍有非常重要的价值.通过前期大量的筛选工作与预实验发现，EEPM能够舒张预收缩小鼠气管平滑肌.故本文就对其作用机理做了相关的研究.

哮喘的典型症状之一是气管平滑肌持续性收缩，而Ca2+在平滑肌收缩的过程中发挥着极其重要的作用.外钙内流和内钙释放共同调节细胞中的Ca2+浓度，从而使平滑肌细胞收缩或舒张[12].VDCCs通道可分为L、N、P、Q、R和T型，其中L型VDCCs通道存在于肌肉组织中，与外钙内流有关[13].NSCCs中的TRP通道可以转运Ca2+以及其他阳离子[14]，而NCX通道可以通过膜电位以及膜两侧Na+与Ca2+浓度差快速精确地调节细胞内钙浓度[15].这三个通道均参与了细胞内Ca2+浓度的调节，与气管平滑肌的收缩舒张密切相关.

利用张力换能器，本文发现EEPM能够不同程度地舒张高钾和ACh预收缩的小鼠气管平滑肌，而这可能与气管平滑肌细胞上的VDCCs和其他离子通道有关.VDCCs通道介导了外钙内流.本文证实了EEPM能够像VDCCs阻断剂Nifedipine一样阻断VDCCs离子通道，使外钙无法内流，从而舒张高钾预收缩的小鼠气管.在ACh预收缩的气管中，阻断VDCCs通道后，EEPM能够通过影响NSCCs和NCX等通道使气管舒张.而活体实验结果也表明EEPM能够一定程度地降低ACh引起的Rrs的上升.基于EEPM能够有效地缓解小鼠气道平滑肌的收缩，它有望成为一种用于哮喘治疗的中草药.

随着对哮喘发病机制更深入的研究，人们逐渐意识到哮喘虽是一种异质性疾病，但是它的发病机制和气道炎症有一定的关系[11].气道炎症的产生能够引发气道高反应，使得气道平滑肌痉挛[16].本文仅探讨了EEPM对收缩的小鼠气管环中离子通道的影响，它是否会对小鼠气道炎症有影响还需进一步研究.